Vesna Hodnik INTERAKCIJE PROTEINOV NLP Z LIPIDNIMI MEMBRANAMI. Nep1-LIKE PROTEIN LIPID MEMBRANE INTERACTIONS

Transcription

1 Medicinska fakulteta Interdisciplinarni doktorski študijski program Biomedicina Biokemija in molekularna biologija Vesna Hodnik INTERAKCIJE PROTEINOV NLP Z LIPIDNIMI MEMBRANAMI Nep1-LIKE PROTEIN LIPID MEMBRANE INTERACTIONS Doktorska disertacija Mentor: prof. dr. Gregor Anderluh Člani komisije: prof. dr. Peter Maček, Biotehniška fakulteta prof. dr. Igor Križaj, Institut Jožef Stefan prof. dr. Matjaž Zorko, Medicinska fakulteta Ljubljana, 2017

2 Vesna Hodnik INTERAKCIJE PROTEINOV NLP Z LIPIDNIMI MEMBRANAMI Imenovanje mentorja na seji senata dne Komisija za oceno in zagovor imenovana na seji senata dne Datum zagovora: 17. maj 2017 Mentor: prof. dr. Gregor Anderluh Predsednik komisije: prof. dr. Peter Maček (BF) Član: prof. dr. Igor Križaj (IJS) Član: prof. dr. Matjaž Zorko (MF)

3 Doktorska naloga je bila opravljena na Katedri za biokemijo, Oddelka za biologijo, Biotehniške fakultete, Univerze v Ljubljani. Del raziskav je potekal v Laboratoriju za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo, Kemijskega inštituta v Ljubljani, v Centru za rastlinsko molekularno biologijo, Univerze v Tübingnu (Nemčija) ter v Laboratoriju za biologijo lipidov, inštituta Riken (Japonska). Glikozide in knjižnico spojin so pripravili na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani. The research part of this doctoral thesis was carried out at the Chair of Biochemistry at the Department of Biology, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana. A part of the study was performed in the Laboratory for Molecular Biology and Nanobiotechnology, National Institute of Chemistry, Ljubljana, at the Center for Plant Molecular Biology, University of Tübingen (Germany) and in the Lipid Biology Laboratory at Riken (Japan). Glycosides and compound library were done at the Faculty od Pharmacy, University of Ljubljana. Doktorska naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela. I

4 KAZALO VSEBINE KAZALO SLIK... V KAZALO PREGLEDNIC... VI KRATICE IN OKRAJŠAVE... VII POVZETEK... X SUMMARY... XII 1 UVOD PREGLED OBJAV PROTEINI NLP Podobnost v zgradbi proteinov NLP z drugimi proteinskimi družinami IMUNSKI ODZIV PRI RASTLINAH PLAZMALEMA Lipidi v rastlinski plazmalemi SFINGOLIPIDI PRI KVASOVKAH ŠKODLJIVCI IN NJIHOVO ZATIRANJE Bolezni, ki jih povzročajo rastlinski patogeni mikroorganizmi Male spojine za zatiranje rastlinskih bolezni Inhibitorji proteinov NLP Detekcija toksinov, ki jih izločajo rastlinski škodljivci NAMEN DELA IN HIPOTEZE MATERIALI IN METODE Materiali Kemikalije Kvasovke Tobak Proteini Protitelesa Lipidi Raztopine in gojišča Metode II

5 4.2.1 Gojenje rastlin Nicotiana tabacum Odstranitev kloroplastov in ekstrakcija celotnih lipidov iz tobaka Gojenje kvasovk za izolacijo sfingolipidov in ekstrakcija sfingolipidov iz kvasovk Tankoplastna kromatografija (TLC) Detekcija lipidov na plošči TLC Obogatitev lipidov iz frakcije F in njihova frakcionacija NaDS-PAGE in odtis western Prenos lipidov na membrano PVDF (ang. TLC-blotting) Detekcija proteinov po prenosu na membrano PVDF Priprava večslojnih veziklov (MLV) Priprava malih enoslojnih/unilamelarnih veziklov (SUV) Merjenje vezave proteina NLP Pya na vezikle z metodo SPR Imobilizacija proteinov NLP na senzorski čip Merjenje vezave sfingolipidov na protein NLP Pp z metodo SPR Gojenje kvasovk za pripravo protoplastov Priprava protoplastov kvasovk Označevanje proteinov Vezava NLP Pya na protoplaste kvasovk - konfokalna mikroskopija in pretočna citometrija Študij vezave inozitol fosfatov na NLP Pp z metodo SPR Študij vezave sladkorjev na NLP z metodo SPR Študij vezave glikozidov na NLP Pp z metodo SPR Izbor spojin iz baze spojin Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani Analiza spojin Test vezave malih spojin na protein NLP Pya z metodo SPR Testi toksičnosti spojin na celicah Caco Infiltracija proteinov NLP v liste tobaka REZULTATI Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami Ekstrakcija celotnih lipidov iz listov tobaka Ekstrakcija sfingolipidov iz kvasovk Razvoj lipidnih ekstraktov s tankoplastno kromatografijo (TLC) Detekcija vezave proteina NLP Pp na celotne lipide iz tobaka in sfingolipide iz kvasovk Odtis western Detekcija vezave proteina NLP Pya na GIPC iz tobaka Vezava proteina NLP Pya na SUV pripravljene iz sfingolipidov BY in MYY Vezava ekstraktov GIPC na protein NLP Pp Interakcija fluorescenčno označenega proteina NLP Pya s protoplasti kvasovk Vezava inozitol fosfatov na NLP Vezava sladkorjev na protein NLP Vezava glikozidov Infiltracije mutantov Zaviranje nekrotične aktivnosti proteinov NLP Test vezave spojin na NLP Pya iz baze spojin Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani Infiltracija proteinov iz družine NLP s spojinami v liste tobaka Toksičnost spojin za celice Caco Načrtovanje različic spojine 6G7 in test novih spojin RAZPRAVA III

6 6.1 INTERAKCIJA PROTEINOV NLP Z RECEPTORJEM Receptor za proteine NLP je lipidna molekula Proteini NLP se vežejo na sfingolipide iz kvasovk GIPC Razlike med enokaličnicami in dvokaličnicami FITOFARMACEVTSKE SPOJINE ZA ZATIRANJE ORGANIZMOV Z NLP-JI Testiranje spojin iz baze spojin Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani Tri najbolj obetavne spojine Optimizacija najbolj obetavne spojine 6G ZAKLJUČKI LITERATURA ZAHVALA IV

7 KAZALO SLIK Slika 1. Aktivnost proteinov NLP Slika 2. Podobnost sekundarne zgradbe proteinov iz družine NLP, aktinoporinov in lektinov Slika 3. Zaznavanje molekul PAMP in DAMP Slika 4. Kompleks RLP23-SOBIR1-BAK Slika 5. Shema kompleksnih sfingolipidov pri rastlinah Slika 6. Analiza GIPC, ekstrahiranih iz celične kulture tobaka BY-2 in listov tobaka Slika 7. Model organizacije lipidov v membrani tobaka Slika 8. Sfingolipidi pri kvasovkah Slika 9. Krompirjeva plesen Slika 10. Obogatitev lipidov iz frakcije F Slika 11. Prenos lipidov iz plošče HPTLC na membrano PVDF Slika 12. Primer imobilizacije proteina NLP Pp preko aminskih skupin na senzorski čip CM Slika 13. Celotni ekstrakt lipidov iz tobaka Slika 14. Vezava proteina NLP Pp na frakcijo F in sfingolipide BY Slika 15. Vezava proteina NLP Pp na frakcijo F, podfrakcijo F-2 in sfingolipide BY in MYY Slika 16. Protitelesa, proizvedena proti NLP Pp se vežejo tudi na NLP Pya Slika 17. GIPC, ekstrahirani iz listov tobaka Slika 18. Vezava NLP Pya na SUV, pripravljenih iz sfingolipidov kvasovk BY Slika 19. Vezava proteina NLP Pya na SUV, pripravljenih iz sfingolipidov MYY Slika 20. Vezava GIPC iz A. thaliana in cvetače na NLP Pp Slika 21. Vezava sfingolipidov iz kvasovk na NLP Pp Slika 22. Aktivnost označenega proteina Alexa488-NLP Pya Slika 23. Vezava proteina Alexa488-NLP Pya na protoplaste kvasovk Slika 24. Vezava proteina Alexa488-NLP Pya na kvasovke Slika 25. Netoksični Alexa488-HaNLP3 se na protoplaste ne veže Slika 26. Vezava proteinov Alexa488-NLP Pya in Alexa488-HaNLP3 na protoplaste in kvasovke. 47 Slika 27. Vezava inozitol-1,3-p in inozitol-1,5-p na protein NLP Pp Slika 28. Vezava sladkorjev na protein NLP Pya Slika 29. Titracija sladkorjev, ki se vežejo na protein NLP Pya Slika 30. Titracija glikozidov preko proteina NLP Pp Slika 31. Infiltracija proteina NLP Pya in mutant v liste tobaka Slika 32. Primeri vezave spojin iz zbirke spojin Fakultete za farmacijo na NLP Pya Slika 33. Titracija šestih najbolj obetavnih spojin na NLP Pya Slika 34. Vezava spojin 6G7, 7C8 in 6C3 na NLP Pp Slika 35. Infiltracija NLP Pya v liste tobaka povzroči nekrotične lezije Slika 36. Učinki spojin na delovanje proteinov NLP Slika 37. Vpliv inhibitorjev na nekrotično aktivnost proteina NLP Pp Slika 38. Vpliv inhibitorjev na nekrotično aktivnost proteina NLP Pya Slika 39. Test toksičnosti spojin 6G7, 6C3 in 7C8 na celice Caco Slika 40. Vezava spojin, derivatov spojine 6G V

8 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1. Seznam patogenov s proteini NLP in bolezni, ki jih povzročajo Preglednica 2. Seznam proteinov, ki smo jih uporabili v nalogi Preglednica 3. Vzorci lipidov za test na vezavo NLP Pp s SPR Preglednica 4. Seznam glikozidov Preglednica 5. Čistost spojin Preglednica 6. Koncentracija ekstrahiranih lipidov iz homogenata tobakovih listov Preglednica 7. Seznam testiranih sladkorjev z metodo SPR Preglednica 8. Strukture šestih najbolj obetavnih spojin in kontrole po testiranju s SPR Preglednica 9. Primerjava vrednosti K D za spojini 6G7 in 7C Preglednica 10. Seznam derivatov spojine 6G Preglednica 11. Strukture spojin, izvedenih iz 6G7, ki se vežejo na NLP z boljšo afiniteto VI

9 KRATICE IN OKRAJŠAVE ABL ASG BcNEP1-2 BSA BY BY-2 CDC Cer ChNLP1-6 CIB CM5 CM7 Da DAMP DGDG DMSO DNA DOPC DTT ECL EDC EDTA EGTA EHM ESI-MS ETI Fc flg22 FS Gal GHRHDWE GIPC GlcCer GlcR1 GPI HaNLP3 HEPES IPC K D lektin iz glive Agaricus bisporus steril glikozidi z maščobno kislino (ang. acyl steryl glycosides) NLP-ja pri Botrytis cinerea goveji serumski albumin (ang. bovine serum albumine) sev kvasovke Saccharomyces cerevisiae BY4747 celična kultura tobaka Bright Yellow-2 od holesterola odvisni citolizini (ang. cholesterol dependent cytolysins) ceramid NLP-ji pri Colletotrichum higginsianum pufer za izolacijo kloroplastov (ang. chloroplast isolation buffer) senzorski čip s karboksiliranim dekstranskim matriksom za vezavo proteinov senzorski čip s karboksiliranim dekstranskim matriksom za vezavo proteinov, ki omogoča višji nivo imobilizacije Dalton razgradni produkti rastlinske celice, ki nastanejo kot posledica okužbe s patogenom (ang. damage-associated molecular patterns) digalaktozil diacilglicerol dimetil sulfoksid deoksiribonukleinska kislina 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin ditiotreitol elektrokemiluminiscenca (ang. electrochemiluminescence) 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorid etilendiamintetraocetna kislina etilen glikol-bis(2-aminoetil eter)-n,n,n',n'-tetraocetna kislina zunajhaustorijalni matriks (ang. extrahaustorial matrix) masna spektrometrija z ionizacijo z elektrorazprševanjem (ang. electrospray ionisation mass spectrometry) imunost, ki jo prožijo efektorji (ang. effector-triggered immunity) pretočna celica (ang. flow cell) molekula PAMP, sestavni element bakterijskega bička fitosfingozin galaktoza visoko ohranjeno zaporedje aminokislin pri proteinih NLP glikozil inozitol fosforilceramid (ang. glycosyl inositol phosphorylceramide) glikozilirani ceramid glukoza s hidroksilno, aminsko ali acetilaminsko skupino glikozilfosfatidilinozitol NLP pri Hyaloperonospora arabidopsidis 4-(2-hidroksietil)piperazin-1-etansulfonska kislina inozitol fosforilceramid (ang. inositol phosphorylceramide) konstanta disociacije VII

10 LCB dolgoverižna baza (ang. long-chain base) lizo-ipc D-eritro-sfingozil fosfoinozitol LRR domena, bogata z levcini (ang. leucin-rich repeat) L1 senzorski čip z acilnimi verigami za imobilizacijo lipidnih veziklov MALDI ionizacija v matriksu z desorpcijo z laserjem (ang. matrix-assisted laser desorption/ionization) MALDI- TOF MALDI z masnim analizatorjem na čas preleta ionov MAMP molekularni vzorci prisotni na površini mikroorganizma (ang. microbeassociated molecular patterns) MAPK ang. mitogen-activated protein kinases MEM minimalno gojišče za celice (ang. minimum essential medium) MES 2-(N-morfolino) etansulfonska kislina MIPC manozilinozitol fosforilceramid (ang. mannosylinositol phosphorylceramide) M(IP)2C manozildiinozitol fosforilceramid (ang. mannosyldiinositol phosphorylceramide) MLV večslojni vezikli (ang. multilamelar vesicles) MpNEP1-5 NLP-ji pri Moniliophthora perniciosa MQ-voda deionizirana voda, filtrirana skozi filtre s porami s premerom 0,22 μm MTT 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolijev bromid (ang. tetrazolium dye) MW molekulska masa MYY mutiran sev kvasovke Saccharomyces cerevisiae z oznako MYY89 N-Ac-Gal N-acetil-galaktozamin NaDS natrijev dodecilsulfat NaDS-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata NEP1 ang. Necrosis and ethylene inducing peptide 1 NGA N-acetilgalaktozamin NHS N-hidroksisukcinimid NLP protein, podoben proteinu Nep1 (ang. Nep1-like proteins) NMR jedrska magnetna resonanca (ang. nuclear magnetic resonance) NLP Pcc NLP pri Pectobacterium carotovorum NLP Pp NLP pri Phytophthora parasitica NLP Pya NLP pri Pythium aphanidermatum OD optična gostota OG oktil β-d-glukopiranozid PAMP molekularni vzorci prisotni na površini patogenega organizma (ang. pathogenassociated molecular patterns) PBS fosfatni pufer PFT porotvorni toksini (ang. pore-forming toxins) PiNPP1/ NPP1 NLP pri Phytophthora infestans PIP 2 fosfatidilinozitol bifosfat PM plazmalema, plazemska membrana POPC 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin PRR receptor, ki zaznava molekule PAMP (ang. pattern recognition receptor) PS fosfatidil serin PsNLP1/PsojNIP NLP pri Phytophthora sojae VIII

11 PTFE PTI PVDF R imm R max ROS RU SD SG SM SPR STD-NMR SUV TBS THF TLC Tris UV XCL YPD α-pft β-pft politetrafluoroetilen imunost, ki jo prožijo molekule PAMP (ang. PAMP-triggered immunity) poliviniliden fluoridna membrana nivo imobilizacije liganda maksimalni odziv analita reaktivna kisikova spojina (ang. reactive oxygen species) odzivna enota (ang. response unit) standardni odklon steril glikozidi (ang. steryl glycosides) sfingomielin površinska plazmonska resonanca (ang. surface plasmon resonance) ang. saturation transfer difference nuclear magnetic resonance mali enoslojni vezikli (ang. small unilamelar vesicles) pufer za spiranje tetrahidrofuran tankoplastna kromatografija (ang. thin-layer chromatography) 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol ultravijolično lektin iz glive Xerocomus chrysenteron gojišče za gojenje kvasovk PFT, ki v membrano vgradijo α-vijačne strukture PFT, ki tvorijo β-sodčkaste pore IX

12 POVZETEK Predstavnike iz družine proteinov NLP (ang. Nep1 (Necrosis and ethylene inducing peptide 1)-like proteins) izločajo bakterije, oomicete in glive. V dvokaličnicah prožijo imunske odzive, ki so podobni tistim, ki jih sicer prožijo molekularni vzorci prisotni na površini mikroorganizmov (t. i. molekule PAMP oziroma ang. pathogen-associated molecular patterns), medtem ko so enokaličnice na njihovo delovanje neobčutljive zaradi do sedaj še nepojasnjenega razloga. Rastline zaznavajo molekule PAMP s transmembranskimi receptorji, aktivira se imunski odziv in tako zajezijo širjenje okužbe. Uspešni rastlinski škodljivci so se prilagodili na primarni imunski odziv z efektorskimi molekulami, ki so dostavljene neposredno v rastlinsko citoplazmo. Proteini NLP delujejo tudi kot efektorske molekule, kar vodi v drugo stopnjo imunskega odziva. Mehanizem delovanja proteinov NLP do sedaj ni bil poznan, podobnost v njihovi zgradbi z zgradbo aktinoporinov pa je vodila k hipotezi, da je tarča proteinov NLP lipid v rastlinski plazmalemi. Pokazali smo, da proteini NLP res prepoznavajo specifični lipid v rastlinski plazmalemi, še več, potrdili smo, da je ta lipid glikozil inozitol fosforilceramid (GIPC). NLP-ji so se vezali tudi na strukturno zelo podobne sfingolipide iz kvasovk ter na kvasne protoplaste. Posamezni sestavni elementi molekul GIPC (glukuronska kislina, glukozamin, manozamin, inozitol-1,3-fosfat in inozitol-1,5-fosfat) so se s šibko afiniteto vezali na proteine NLP. Šibka vezava delov GIPC je bila pričakovana, saj je za popolno interakcijo in s tem večjo afiniteto potrebna celotna molekula GIPC. Najverjetneje do razlik v občutljivosti rastlin na proteine NLP pride zaradi razlik v sestavi GIPC. GIPC pri dvokaličnicah, ki so občutljive na NLP-je, vsebujejo disaharid, vezan na inozitol fosforilceramid, enokaličnice pa imajo na inozitol fosforilceramid vezan trisaharid. Protein NLP Pya ima v svoji strukturi votlino, ki je pomembna za nekrotično aktivnost proteina in predvidevamo, da se GIPC iz dvokaličnic ob vezavi umestijo v to votlino s svojim končnim sladkornim delom, medtem ko pri enokaličnicah najverjetneje do tega ne pride. Razjasnjen prvi korak v stiku proteinov NLP z rastlinsko celico nas je vodil v načrtovanje novih spojin, ki bi ta kontakt med patogenim mikroorganizmom in rastlinsko celico uspešno blokirale in s tarčnim delovanjem preprečile škodljive učinke, ki jih imajo predvsem oomicete in glive na razne industrijsko pomembne rastline. Izvedli smo strukturno podprto rešetanje knjižnic malih spojin, pridobili nekaj tarčnih spojin in poleg njih testirali tudi vezavo spojin, ki so nam bile na voljo v knjižnici spojin Fakultete za farmacijo. Identificirali smo tri male spojine, ki bi lahko bile uporabne kot fitofarmacevtske učinkovine pri zatiranju patogenov, ki izločajo NLP-je. Spojine so se vezale na proteina NLP Pya in NLP Pp, zmanjšale ali celo izničile nekrotičen učinek proteinov ob infiltraciji v liste tobaka ter zatirale rast patogenega organizma na listih krompirja. Dve X

13 spojini in vse njune možne derivate smo prijavili v patentni prijavi na Evropskem patentnem uradu. Spojine bodo lahko uporabljene za kontrolo rasti škodljivcev, kot je npr. Phytophthora, ki je v preteklosti povzročila precej izgub pridelka zaradi krompirjevega in paradižnikovega ožiga. XI

14 SUMMARY Nep1 (Necrosis and ethylene inducing peptide 1)-like proteins (NLPs) that are secreted by bacteria, fungi and oomycetes are known to trigger immune responses and plant cell death in dicotyledonous plants. Monocotyledonous plants are insensitive to NLPs due to unexplained reason. NLPs cause immune responses that are similar to those triggered by molecular patterns present on the surface of the pathogenic organisms. Successful plant pests have adapted to a primary immune response with effector molecules which are delivered directly to the plant cytoplasm. Additionally, NLPs were reported to act as effectors, which leads to the second stage of the immune responses. The structural similarity with actinoporins has led to the hypothesis that the target molecule in plant plasma membrane is of lipid origin. We have shown that NLPs recognize specific lipid in the plasma membrane plant, and even more, we confirmed that this lipid belongs to the the class of glycosyl inositol phosphorylceramides (GIPC). NLPs are able to recognize structurally similar sphingolipids of yeast cells and bind to the yeast protoplasts. Individual building elements of GIPC (glucuronic acid, glucosamine, mannosamine, inositol-1,3- phosphate and inositol-1,5-phosphate) have weak affinity to NLPs. Weak binding of building blocks was expected, as the perfect interaction and thus greater affinity most probably requires complete GIPC. The differences in the sensitivity of plants to NLPs most likely occur due to differences in the composition of GIPC. GIPC of dicot plants which are sensitive to the NLPs contain a disaccharide bound to inositol phosphorylceramide, while monocots have trisaccharide bound to the inositol phosphorylceramide. Protein NLP Pya structure contains a small cavity which was shown to be important for the necrotic activity of the protein and we predict that the GIPC of dicots can fit into this cavity with its final sugar part. Known first step in the NLP-plant interaction led us to design new compounds that would interrupt the contact between the pathogenic organisms and plants and finally block the devastating effects that can have oomycetes and fungi on various crops. We have identified three compounds that may be useful as phytopharmaceuticals for plant pathogen control. Two compounds and all their possible derivatives were reported in patent application at the European Patent Office and could be used in future for controlling oomycetes of the genus Phytophthora causing potato and tomato blight. XII

15 1 UVOD Proteini iz rastlinskih škodljivcev, kot sta Phytophthora infestans, ki povzroča krompirjevo plesen in bolezni pri mnogih poljščinah in Moniliophthora perniciosa, ki uničuje pridelke kakavovca, tvorijo družino proteinov NLP (ang. Nep1 (Necrosis and ethylene inducing peptide 1)-like proteins). Poleg oomicet najdemo proteine NLP tudi pri bakterijah in glivah. Nahajajo se tako pri biotrofnih kot tudi nekrotrofnih rastlinskih škodljivcih. V rastlinah prožijo imunske odzive, ki so podobni tistim, ki jih sicer prožijo molekularni vzorci prisotni na površini patogenega organizma (t. i. molekule PAMP oziroma ang. pathogen-associated molecular patterns). Med molekule PAMP sodi recimo bakterijski flagelin, ki se nahaja v bičku in ga rastline zaznavajo s transmembranskimi proteini. Aktivacija teh receptorjev vodi v dobro opisan primarni imunski odziv. Uspešni rastlinski škodljivci so se prilagodili na ta odziv z efektorskimi molekulami, ki so dostavljene neposredno v rastlinsko citoplazmo. Proteini NLP delujejo tudi kot efektorske molekule, kar vodi v drugo stopnjo imunskega odziva pri rastlini. V resnici ostre meje med molekulami PAMP in efektorskimi molekulami ni, saj imajo proteini NLP, pa tudi drugi proteini, ki prožijo imunske odzive, hkrati značilnosti enih in drugih molekul. Mehanizem delovanja proteinov NLP do sedaj ni bil poznan, podobnost v njihovi zgradbi z zgradbo aktinoporinov pa vodi k hipotezi, da morda tudi za proteine NLP prvi stik z gostiteljsko celico predstavlja stik z lipidnim gradnikom plazmaleme. Razjasnjen mehanizem prvega stika proteina NLP s tarčno celico bi bil poleg splošnega vedenja o delovanju teh proteinov tudi odskočna deska za načrtovanje novih spojin, ki bi kontakt med patogenim mikroorganizmom in rastlinsko celico uspešno blokirale in s tem preprečile škodljive učinke, ki jih imajo predvsem oomicete in glive na razne pomembne industrijske rastline. Z bolj tarčnim delovanjem bi se lahko izognili morebitnim negativnim posledicam, ki jih ima sicer zdajšnja uporaba raznih fungicidov na pitno vodo, vodne in terestrične organizme. 1

16 2 PREGLED OBJAV 2.1 PROTEINI NLP Družina proteinov NLP (ang. Nep1-like proteins) je poimenovana po proteinu Nep1 (ang. Necrosis and ethylene inducing peptide 1), ki je bil kot prvi predstavnik iz te družine opisan leta 1995 po izolaciji iz znanega rastlinskega škodljivca, glive Fusarium oxysporum (Bailey, 1995). Proteini NLP ob infiltraciji v liste dvokaličnic prožijo sintezo etilena in nastanek nekroz (Slika 1). Opisani so bili pri mnogih bakterijah, oomicetah in glivah (Gijzen in Nürnberger, 2006; Oome in Van den Ackerveken, 2014). Prožijo imunske odzive pri dvokaličnicah, ne pa pri enokaličnicah (Gijzen in Nürnberger, 2006; Oome s sod., 2014; Pemberton in Salmond, 2004), vendar še ni znan vzrok za te razlike. Slika 1. Aktivnost proteinov NLP. Po infiltraciji proteinov iz družine NLP v spodnjo povrhnjico lista nastanejo nekroze. 0,5 µm raztopino proteinov NLP Pcc (Pectobacterium carotovorum), NLP Pp (Phytophthora parasitica) in NLP Pya (Pythium aphanidermatum) so vbrizgali v spodnjo povrhnjico lista tobaka in nekroze fotografirali tri dni kasneje. Slika prirejena po Ottmann s sod., Proteini NLP imajo molekulsko maso okoli 24 kda in vsebujejo domeno NPP1 z visoko ohranjenim zaporedjem sedmih aminokislin GHRHDWE (Pemberton in Salmond, 2004; Qutob s sod., 2006). Glede na filogenetske analize so proteine NLP sprva uvrščali glede na število cisteinov v tip 1 z dvema ohranjenima cisteinoma in tip 2 s štirimi ohranjenimi cisteini (Gijzen in Nürnberger, 2006). Nedavno je bila po analizi več kot 500 zaporedij proteinov NLP odkrita še tretja skupina (Oome in Van den Ackerveken, 2014). Proteine NLP tipa 1 izločajo bakterije, oomicete in glive, tip 2 najdemo pri bakterijah in glivah, medtem ko je novo opisani tip 3 moč najti le pri glivah (Oome in Van den Ackerveken, 2014). Predstavniki tipa 3 se precej razlikujejo od tipa 1 in 2, saj imajo enak le osrednji del s 50-imi aminokislinami, vključno z visoko ohranjenim motivom GHRHDWE, v ostalem 2

17 delu pa so proteini tipa 3 zelo drugačni. Večina proteinov NLP vsebuje signalni peptid, kar nakazuje na njihovo zunajcelično aktivnost. Poročali so, da protein PsojNIP iz Phytophthora sojae povzroča nekrozo samo, če ima ohranjen signalni peptid (Qutob s sod., 2002). V genomu gliv običajno najdemo po en ali nekaj zapisov za proteine NLP (Preglednica 1). Glive Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea in B. elliptica imajo po dva zapisa za NLP (Dallal Bashi s sod., 2010; Schouten s sod., 2008; Staats s sod., 2007), medtem ko imata F. oxysporum in Mycosphaerella graminicola po en sam zapis za protein NLP (Bailey s sod., 1997; Motteram s sod., 2009). Le redke glive imajo po več zapisov za te proteine, npr. Verticillium dahlie, pri katerem najdemo devet proteinov NLP (Zhou s sod., 2012). Tudi pri bakteriji Pectobacterium carotovorum najdemo le eno kopijo proteina NLP (Mattinen s sod., 2004). Število genov za proteine NLP pri oomicetah pa je močno povečano in imajo zato najverjetneje pomembno vlogo v življenjskem ciklu teh organizmov. Tako ima Pythium ultimum sedem proteinov NLP (Lévesque s sod., 2010), Hyaloperonospora arabidopsidis ima 15 psevdogenov NLP in 12 genov NLP, od katerih se jih osem izraža med infekcijo rastlin (Cabral s sod., 2012). Največje število proteinov NLP najdemo pri rodu Phytophthora. V genomu P. sojae je tako 33 zapisov za gene NLP, od katerih se jih 20 izraža (Dong s sod., 2012), P. capsici ima 18 (Feng s sod., 2011), P. infestans ima 27, P. ramorum pa kar 59 proteinov iz družine NLP (Haas s sod., 2009). Med rastlinskimi patogeni ločimo glede na njihov način prehranjevanja biotrofe, nekrotrofe in hemibiotrofe. Biotrofni patogeni se hranijo z živimi celicami in povzročijo minimalno škodo na celičnih stenah ob prodiranju. Nekrotrofni organizmi povzročijo največjo škodo, saj ubijejo celice in uporabijo sproščeni material, medtem ko je za hemibiotrofne škodljivce v začetku značilna biotrofna faza, kateri sledi nekrotrofna faza (Parbery, 1996). Nekatere študije kažejo, da je izražanje proteinov NLP povezano s prehodom iz biotrofnega na nekrotrofno fazo življenja oomicete in tako trdijo, da proteini NLP prispevajo k odmiranju gostiteljske celice. Izražanje PsNLP1 pri P. sojae je bistveno povečano 48 ur po infekciji (Qutob s sod., 2002), PiNPP1.1 pri P. infestans je zaznati le v fazah pozne okužbe, medtem ko se PiNPP1.2 in PiNPP1.3 kopičita, ko se okužba še razvija (Kanneganti s sod., 2006). Nekateri novejši rezultati so pokazali, da se nekateri NLP-ji pri P. infestans razvijajo v zgodnji biotrofni fazi (Haas s sod., 2009). Izražanje NLP-jev v različnih fazah življenjskega cikla kaže na veliko pestrost funkcij, ki jih imajo. Proteini NLP se razlikujejo tudi glede na delovanje, saj nekateri predstavniki povzročajo nekroze listnega tkiva (Slika 1), drugi pa ne povzročajo nekroz (Cabral s sod., 2012; Dong s sod., 2012; Zhou s sod., 2012). Biotrofna gliva Colletotrichum higginsianum, ki je škodljivec na križnicah, ima šest kopij zapisa za proteine NLP, za katere so tudi pokazali, da se izražajo v različnih fazah razvoja. ChNLP1 se tako izraža specifično ob pričetku nekrotrofnega 3

18 načina življenja patogena in je citotoksičen, medtem ko se ChNLP3 izraža v apresorijih in ni povzročal nekroz (Kleemann s sod., 2012). Obligatni biotrof H. arabidopsidis vsebuje 12 proteinov iz družine NLP, ki ne povzročajo nekroz, kljub temu pa prožijo imunski sistem pri Arabidopsis thaliana (Oome s sod., 2014). Različen vzorec izražanja ter toksični in netoksični predstavniki te družine nakazujejo, da imajo proteini NLP številne funkcije v življenju patogenega organizma, ki pa še niso dobre poznane. Biološka vloga proteinov NLP je še nepojasnjena in vprašanje, ali so nekroze posledice proženja imunskega odziva v rastlini ali delujejo toksično neposredno s citolitičnim delovanjem na lipidne membrane, ostaja še vedno odprto. Tretiranje rastlin A. thaliana z rekombinantnimi NLP-ji je prožilo hitro aktivacijo genov, povezanih z obrambo in celično smrtjo (Bae s sod., 2006; Qutob s sod., 2006). Pokazali so tudi, da je za aktivacijo nekroz s proteinom NPP1 v tobaku nujno potrebna svetloba in aktiven metabolizem (Qutob s sod., 2006). Po drugi strani pa so citolitično aktivnost proteinov NLP potrdili eksperimentalno, ko so pokazali, da NLP-ji povečajo prepustnost veziklov, pripravljenih iz membran dvokaličnic. Citotoksičnost je posledica puščanja membrane, kar vodi v aktivacijo obrambnega mehanizma pri rastlini in celično smrt. Vezikli, pripravljeni iz enokaličniških plazmalem Commeline communis so bili odporni na inkubacijo s proteini NLP (NLP Pya iz Pythium aphanidermatum, NLP Pp iz Phytophthore parasitica, NLP Pcc iz Pectobacterium carotovorum) (Ottmann s sod., 2009). Za proteine NLP so večkrat pokazali, da delujejo nekrotično le na dvokaličnice (Motteram s sod., 2009), do česar morda pride zaradi različne sestave plazmaleme enokaličnic in dvokaličnic Podobnost v zgradbi proteinov NLP z drugimi proteinskimi družinami Do sedaj sta bili objavljeni dve zgradbi proteinov NLP tipa 1, zgradba proteina NLP Pya, ki ga izloča oomiceta P. aphanidermatum (PDB:3GNU) (Ottmann s sod., 2009) in zgradba MpNEP2 bazidiomicete Moniliophthora perniciosa (PDB:3STI) (Zaparoli s sod., 2011). Ugotovljeno je bilo, da so proteini NLP strukturno podobni aktinoporinom, proteinom iz morskih vetrnic, ki delujejo citolitično na membrane in glivnim lektinom (Küfner s sod., 2009; Ottmann s sod., 2009) (Slika 2). Imajo eno domeno, ki jo tvori osrednji β-sendvič s tremi trakovi v eni ravnini in petimi trakovi v nasprotni ravnini. Prisotni so še trije α- heliksi in tri zanke L1-L3 na spodnjem koncu molekule. Med zankama L2 in L3 se nahaja votlinica z vezanim Mg 2+ (Ottmann s sod., 2009). Mehanizem vezave aktinoporinov na lipidni dvosloj je dobro poznan in vključuje oligomerizacijo proteinov na površini membrane, ki vsebuje sfingomielin, čemur sledi nastanek pore (Anderluh in Lakey, 2008; Črnigoj Kristan s sod., 2009; Rojko s sod., 2016). Mehanizem vezave NLP-jev na membrane rastlinskih celic do sedaj še ni bil opisan. Točkovne mutacije določenih aminokislin (podčrtane) v motivu GHRHDWE pri NLP Pya so izničile nekrotično aktivnost proteina. Ključne aminokisline so bile del votlinice, v kateri se nahaja dvovalentni kation. Pri mutacijah omenjenih aminokislin v histidin, aspartat in glutamat ni bilo opaženih lezij 4

19 na površini listov (Ottmann s sod., 2009). Glede na rezultate teh študij so predlagali, da je votlina s kationom pomembna za vezavo polarnih glav membranskih lipidov (Küfner s sod., 2009). Slika 2. Podobnost sekundarne zgradbe proteinov iz družine NLP, aktinoporinov in lektinov. Sekundarna zgradba proteinov NLP Pya (A), aktinoporina stiholizin (B) in lektina ABL (C). Vijačnice so prikazane modro, β-trakovi zeleno. L1-L3, zanke; NGA, N-acetilgalaktozamin. Slika prirejena po Ottmann s sod., IMUNSKI ODZIV PRI RASTLINAH Rastline so nenehno izpostavljene mikrobom. Ti v rastlino pridejo s prodiranjem direktno v liste ali korenine ali z vnosom preko ran oziroma naravnih odprtin kot so listne reže. Rastline zaznavajo prisotnost patogenov z različnimi nivoji imunskega sistema. Ta je pri rastlinah kompleksen zaradi vsaj treh razlogov. Prvi je ta, da so rastline pritrjeni organizmi in tako potrebujejo hiter odziv proti patogenu na samem mestu okužbe. Poleg tega rastlinske celice v nasprotju z živalskimi nimajo specializiranih imunskih celic in ne nazadnje so imunski odzivi energetsko potratni in zato potrebujejo strog nadzor nad začetkom, trajanjem in močjo odziva (Macho in Zipfel, 2014). Pri rastlinah poznamo dva tipa imunskega odziva (Boller in Felix, 2009; Jones in Dangl, 2006). Prvi se vključi po zaznavanju molekul, ki so rastlini tuje (Slika 3). To so specifični molekularni vzorci, prisotni na površini mikroba oziroma molekule PAMP (ang. pathogenassociated molecular patterns), ki prožijo t. i. imunost, odvisno od molekul PAMP (ang. PTI, PAMP-triggered immunity). PTI deluje zelo podobno kot naravna oz. prirojena imunost pri živalskih celicah (Boller in Felix, 2009). Do sedaj je bilo opisano zaznavanje bakterijskih in glivnih molekul PAMP, o zaznavanju oomicet pa ni dosti znanega, kljub temu, da se uvrščajo med najštevilčnejše rastlinske škodljivce (Raaymakers in Van den Ackerveken, 2016). Do sedaj dobro opisane molekule PAMP so tako npr. flagelin v bakterijskemu bičku (Felix s sod., 1999), bakterijski peptidoglikan (Gust s sod., 2007) in lipopolisaharid (Newman s sod., 1995) ter hitin v stenah gliv (Felix s sod., 1993). Molekule PAMP so prisotne pri različnih mikroorganizmih, neodvisno od njihove patogenosti, zato se uporablja v literaturi tudi izraz MAMP (ang. microbe-associated molecular patterns) (Boller in Felix, 2009). 5

20 Imunost, ki je posledica zaznavanja molekul PAMP, vodi v nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS, ang. reactive oxygen species), aktivacijo kinaz MAPK (ang. mitogenactivated protein kinases) in izražanje genov, ki so povezani z imunostjo (Boller in Felix, 2009). PTI zadošča za zaustavitev večine mikrobov. Prvi odziv na molekule PAMP se zgodi prej kot v dveh minutah. Pride do alkalinizacije, vdora H + in Ca 2+ ter iztekanja K + in anionov, še posebej nitrata, kar vodi v depolarizacijo membrane. Zelo malo je znanega o tem, kateri ionski kanali sodelujejo v teh procesih (Boller in Felix, 2009). Drugi zgodnji odziv na molekule PAMP, ki se zgodi po približno dveh minutah, je nastanek ROS. Te lahko delujejo direktno na mikroorganizem, prispevajo k obrambi s tem, da utrdijo celično steno ali delujejo kot drugotni stresni signal in inducirajo različne obrambne odzive (Apel in Hirt, 2004). Tretji zgodnji odziv je aktivacija kinaz MAPK. Ko so A. thaliana stimulirali s peptidom flg22 iz bakterijskega bička, so opazili porast aktivnosti kinaze AtMPK6 dve minuti po stimulaciji, z največjo aktivnostjo pet do deset minut po signalu (Nühse s sod., 2000). Molekule PAMP prepoznavajo membranski receptorji PRR (ang. pattern recognition receptor) v gostiteljski celici (Slika 3), ki imajo pogosto domene, bogate z levcini LRR (ang. leucin-rich repeat) (Macho in Zipfel, 2014). Receptorji PRR so preko transmembranskih regij povezani z znotrajceličnimi domenami RLK (ang. receptor-like kinase) in tvorijo komplekse LRR-RK (Shiu in Bleecker, 2003) ali s kratkimi citoplazemskimi proteini RLP (ang. receptor-like proteins) in tvorijo kompleks LRR-RP. Pri A. thaliana so opisali dva receptorska kompleksa LRR-RK za prepoznavo bakterijskih molekul PAMP; FLS2 in EFR, ki prepoznavata bakterijski flg22 (Gómez-Gómez in Boller, 2000) oziroma elf12 (Zipfel s sod., 2006). Bakterijski flagelin zaznavajo tudi živali z zunajcelično domeno LRR receptorjev PRR. Pri vretenčarjih je za prepoznavanje flagelina odgovoren receptor TLR5 (ang. Toll-like receptor) (Hayashi s sod., 2001). Oba receptorja zaznavata evolucijsko dobro ohranjen, a različen del molekule. Podobne imunske odzive lahko prožijo tudi rastlini lastne molekule, ki nastanejo po poškodbi ob prodiranju patogenega organizma, t. i. molekule DAMP (ang. damageassociated molecular patterns) (Lotze s sod., 2007). Patogeni pogosto izločajo razne litične encime, ki pripomorejo k hitrejši okužbi gostiteljskega organizma. Produkti razgradnje se pojavijo v rastlinskem apoplastu in delujejo kot signal za nevarnost, podobno kot molekule PAMP. 6

21 Slika 3. Zaznavanje molekul PAMP in DAMP. Receptorji PRR zaznavajo rastlinski celici (zeleno) tuje molekule (molekule PAMP), ki se pojavijo v rastlinskem apoplastu (belo) ali v zunajhaustorijalnem matriksu (rdeče) ob prodiranju oomicet (oranžno). Receptorji (modro) zaznavajo tudi dele rastlinske membrane (molekule DAMP) ali celične stene patogenega organizma, ki nastanejo ob delovanju rastlinskih encimov. PM, plazmalema; EHM, zunajhaustorijalni matriks. Slika prirejena po Raaymakers in Van den Ackerveken, Rastline lahko zaznavajo univerzalne značilnosti mikrobov in sprožijo obrambne odzive, kljub temu pa lahko patogeni mikroorganizmi uspešno okužijo rastlino. Nekateri patogeni so namreč razvili sposobnost, da se izognejo tovrstni odpornosti. Tekom evolucije so razvili odgovor na PTI in razvili virulentne molekule oz. efektorje, ki so običajno dostavljeni neposredno v citoplazmo rastlinske celice in se tako izognejo receptorjem PRR. Izraz efektor se je na področju interakcij med patogenimi organizmi in mikrobi uveljavil z odkritjem, da po Gramu negativne bakterije za infekcijo uporabljajo t. i. sistem tipa III (Block s sod., 2008). Proteini, ki sodelujejo v tem sistemu, prožijo preobčutljivostni odziv pri odpornih rastlinah, t. i. avirulentni odziv. Kasneje so odkrili, da isti proteini prispevajo tudi k virulenci pri neodpornih rastlinah. Tako lahko isti protein deluje na oba načina in se zato izraz Avr kot pojem za avirulentni protein umika iz uporabe in ga je nadomestil izraz efektor, ki se uporablja vse več v literaturi na področju oomicetne in glivne patologije, pa tudi pri interakcijah nematodov z rastlinami. Efektorji so tako vsi proteini in male molekule patogenih organizmov, ki spremenijo zgradbo in/ali funkcijo gostiteljske celice. Te spremembe pripomorejo k virulentnosti (virulentni faktorji in toksini) ali pa 7

22 prožijo obrambne odzive (avirulentni faktorji in elicitorji) ali oboje (Hogenhout s sod., 2009). Evolucijska dinamika pri rastlinah je vodila v razvoj znotrajceličnih receptorjev, t. i. proteinov R-tipa NB-LRR (ang. nucleotide binding-leucine-rich repeat), ki vodijo v nastanek druge stopnje imunskega odziva, t. i. od efektorjev odvisno imunost (ETI, ang. effector-triggered immunity) (Thomma s sod., 2011). Molekule PAMP so običajno osnovni gradniki mikroorganizmov, kot so bakterijski flagelin, peptidoglikan in lipopolisaharid, oomicetni glukani in glivni hitin. Te molekule so zelo ohranjene med različnimi rodovi, medtem ko so efektorji običajno značilni za eno ali nekaj sorodnih vrst. Splošno gledano sta obe imunosti (PTI in ETI) podobni, je pa ETI običajno močnejša in hitrejša in vključuje smrt celic zaradi preobčutljivosti (ang. hypersensitive cell death). PTI je običajno učinkovita pri neprilagojenih patogenih organizmih, medtem ko je ETI vključena v procesih proti odpornim patogenom (Dodds in Rathjen, 2010). Zadnje raziskave kažejo, da ne moremo več potegniti stroge ločnice med molekulami PAMP in efektorji in da so razmerja med PTI in ETI vzajemna (Thomma s sod., 2011). Rastline prepoznavajo različne molekule PAMP in pri večini le-teh gre za prepoznavo kratkih, evolucijsko dobro ohranjenih epitopov, ki niso podvrženi pogostim mutacijam, saj predstavljajo življenjsko pomembne dele organizma. Pokazali so, da tudi proteini NLP vsebujejo kratko aminokislinsko zaporedje, ki je ključni element, ki ga zaznavajo rastline. Gre za peptid iz 20-ih aminokislin, poimenovan nlp20, ki proži imunski odziv pri A. thaliana in sorodnih vrstah iz družine Brassicaceae, podobno kot bakterijski flg22 (Böhm s sod., 2014). Trenutno se v podatkovnih zbirkah nahaja preko aminokislinskih zaporedij podobnih zaporedju proteina NLP Pp (221 bakterijskega, 558 glivnega, 312 oomicetnega izvora). Preliminarni pregled teh zaporedij je pokazal, da večina glivnih in skoraj vsi oomicetni proteini NLP vsebujejo motiv nlp20, medtem ko je ta motiv vsebovalo le 20 zaporedij od 221 bakterijskih. Motiv nlp20 je tako značilen predvsem za evkariontske predstavnike proteinov te družine (Böhm s sod., 2014). Nedavno je bil opisan receptor PRR za motiv nlp20 (Slika 4). To je receptor RLP23, ki se nahaja v membrani in tvori kompleks skupaj s kinazo SOBIR1 (ang. suppressor of Brassinosteroid insensitive 1 (BRI1)-associated kinase (BAK1)-interacting receptor kinase 1). Ob vezavi nlp20 na domeno LRR receptorja RLP23 se kompleksu pridruži še drugi receptor LRR-RK, BAK1 v tridelni kompleks, kar vodi naprej v signalno pot imunskega odziva (Albert s sod., 2015). 8

23 Slika 4. Kompleks RLP23-SOBIR1-BAK1. Proteini NLP vsebujejo kratko aminokislinsko zaporedje nlp20. Proteina RLP23 in SOBIR1 se v membrani rastlinske celice povezujeta, po vezavi nlp20 z RLP23 pa se veže še BAK1, kar aktivira imunski odziv. Slika prirejena po Shibuya in Desaki, Proteini NLP prožijo imunski odziv v rastlini na dva načina. Prvi način izzove motiv nlp20, rastlini tuj molekularni vzorec, ki vodi v klasičen PTI. Motiv nlp20 ima večino značilnosti, ki jih imajo dobro opisane molekule PAMP. Gre za kratko zaporedje aminokislin in je široko razširjen pri taksonomsko različnih organizmih. NLP-ji pa delujejo tudi kot efektorske molekule, kar vodi v imunost, odvisno od efektorjev (Albert s sod., 2015; Shibuya in Desaki, 2015). 2.3 PLAZMALEMA Plazmalema predstavlja 4-6 nm debelo hidrofobno mejo med celico in okoljem, je rezervoar sekundarnih sporočevalcev in hkrati predstavlja medij za proteine, ki imajo različne funkcije v celici. Sodeluje tudi pri zaznavanju patogenih organizmov. Čeprav so strukturno gledano lipidi zgrajeni iz maloštevilnih enostavnih enot, je možnih do skoraj različnih lipidnih molekul, kar kaže na zelo veliko raznolikost v lipidni sestavi membrane (Yetukuri s sod., 2008). Vse lipidne sestavine kljub napredkom v lipidomiki seveda še niso bile opisane. V plazmalemi obstajajo tri glavne skupine lipidov: fosfolipidi, 9

24 steroli in sfingolipidi. Večina lipidov nastane v endoplazmatskem retikulumu, razen sfingolipidov, ki se dokončno oblikujejo v Golgijevem aparatu. Sestava plazmaleme se zelo razlikuje med posameznimi rastlinskimi vrstami in tudi med različnimi organi iste rastline. V plazmalemi se nahajajo tekoče urejene domene oziroma t. i. rafti, ki so obogateni s steroli in sfingolipidi, fosfolipidov pa v raftih skoraj ni. Študije na modelnih lipidih, ki so sicer prisotni v bioloških membranah, so pokazale, da se lipidi samodejno organizirajo v urejene faze, obogatene s steroli in sfingolipidi (Silvius, 2005). Pri rastlinah so prvič poročali o raftih, ko so pri tobaku odkrili frakcijo, netopno v TritonX-100 (Peskan s sod., 2000). Opisane lipidne mikrodomene pri tobaku so vsebovale tudi drugačno proteinsko sestavo kot ostali del plazmaleme, saj so bile močno obogatene s signalnimi proteini. Zadnje študije navajajo, da so membrane v resnici mozaična področja, ki jih vzdržuje citoskelet, vendar ima kemijska narava lipidov pomembno vlogo pri nastanku mikrodomen. Membranski rafti so tako sestavljeni iz lipidov, ki se samostojno uredijo in spodbujajo agregacijo proteinov v molekularne komplekse (Cacas s sod., 2012a) Lipidi v rastlinski plazmalemi V plazmalemi tobaka se nahaja 32 % fosfolipidov, 21 % sterolov in 47 % sfingolipidov (Cacas s sod., 2016). Fosfolipidi pri rastlinah so precej podobni tistim v živalskih celicah. Med fosfolipidi sta najpogostejša fosfatidilholin in fosfatidiletanolamin, najdemo pa tudi fosfatidilglicerol, fosfatidilinozitol, fosfatidilserin ter fosfatidno kislino (Furt s sod., 2010). Steroli in sfingolipidi so različni in specifični za posamezno kraljestvo. Rastlinske celice vsebujejo tri proste sterole: β-sitosterol, stigmasterol in kampesterol, ki so lahko konjugirani z različnimi molekulami v steril glikozide (SG, ang. steryl glycosides) in acil steril glikozide (ASG, ang. acyl steryl glycosides) (Furt s sod., 2010). Sfingolipidi so pri rastlinah razdeljeni v štiri skupine: glikozil inozitol fosforilceramidi (GIPC), glikozil ceramidi, ceramidi in proste dolgoverižne baze LCB (ang. long-chain base) (Pata s sod., 2010). Slednje so osnova vseh rastlinskih sfingolipidov in so večinoma sestavljene iz verige 18-ih ogljikovih atomov, na katero sta pripeti aminska skupina na mestu C2 in alkoholna skupina na mestu C1 ali C3 (Slika 5). Ceramid nastane z acilacijo aminske skupine, maščobna kislina pa lahko vsebuje ogljikovih atomov (Sperling in Heinz, 2003). Ceramidi so zelo raznoliki, saj se med seboj razlikujejo v dolžini obeh verig, lahko so metilirani ali hidroksilirani in vsebujejo različno število nenasičenih vezi. Predstavljajo osnovo za sintezo bolj kompleksnih sfingolipidov. Hidroksilna skupina na LCB je lahko fosforilirana (nastane ceramid fosfat) ali pa je nanjo pripeta sladkorna podenota (nastane glukozil ceramid). Najbolj pogosti sfingolipidi so GIPC, kjer je na ceramid pripet fosforilinozitol, ki je nadalje modificiran z različnim številom sladkornih ostankov (Pata s sod., 2010). Obstaja vsaj 500 različnih vrst sfingolipidov, A. thaliana vsebuje vsaj

25 različnih sfingolipidov (Markham in Jaworski, 2007). Sfingolipidi nastajajo v celicah po dveh poteh: de novo s kondenzacijo serina z acil koencimom A in z razgradnjo bolj kompleksnih sfingolipidov na enostavnejše (Sperling in Heinz, 2003). Slika 5. Shema kompleksnih sfingolipidov pri rastlinah. Sfingolipidi so sestavljeni iz hidrofobnega ceramidnega dela, ki je sestavljen iz dolgoverižne baze in maščobne kisline ter polarne glave. Cer; ceramid, GlcCer; glikozil ceramid, IPC; inozitol fosforilceramid. Slika prirejena po Pata s sod., Sestavni elementi polarne glave pri GIPC so zelo raznovrstni in slabo opisani. Na ceramidni del sta običajno vezana inozitol in glukuronska kislina preko fosfodiestrske vezi (Cacas s sod., 2012b). Na to so lahko vezani mnogi raznovrstni saharidi, ki tvorijo kompleksne GIPC kot so Gal-GlcR1-glukuronska kislina-inozitol-1-fosfoceramid in GlcR1-glukuronska kislina-inozitol-1-fosfoceramid (Gal-galaktoza, GlcR1-glukoza s hidroksilno, aminsko ali acetilaminsko skupino) (Cacas s sod., 2013). Dodatni sladkorji, ki so lahko vezani na inozitol, so arabinoza, galaktoza, manoza ali fukoza (Carter in Koob, 1969; Hsieh s sod., 1981; Pata s sod., 2010; Buré s sod., 2014). Strukturni podatki o sestavi sfingolipidne glave še vedno ostajajo borni, saj je topnost sfingolipidov v klasičnih ekstrakcijskih mešanicah organskih topil slaba in so bili zato v preteklosti GIPC pogosto spregledani, saj so ob ekstrakciji lipidov ostali netopni v usedlini ali vodni fazi. Cacas s sodelavci je leta 2013 objavil protokol za ekstrakcijo GIPC, prirejen po starejšemu protokolu iz leta 1975 (Kaul in Lester, 1975), kjer so GIPC iz dveh modelnih rastlin, A. thaliana in Nicotiana tabacum po ekstrakciji raztopili v mešanici tetrahidrofuran (THF) : metanol : voda = 4 : 4 : 1 in jih s pomočjo MALDI- (ionizacija v matriksu z desorpcijo z laserjem, ang. matrix assisted laser desorption ionisation) in ESI-MS (masna 11

26 spektrometrija z ionizacijo z elektrorazprševanjem, ang. electrospray ionization mass spectrometry) razvrstili v šest serij A-F, kjer serija A vsebuje dve sladkorni podenoti vezani na inozitol fosforilceramid, serija B tri sladkorne podenote in tako naprej do serije F s sedmimi sladkornimi podenotami, vezanimi na inozitol fosforilceramid (Cacas s sod., 2013). Znotraj posamezne serije imajo GIPC enako število sladkorjev v polarni glavi, a se razlikujejo v ceramidnem delu molekule. Vseh šest serij so našli pri celični kulturi tobaka Bright Yellow-2, medtem ko ima tobak daleč največ GIPC iz serije A, tako v listih kot v celični kulturi (Cacas s sod., 2016) (Slika 6). Po analizi GIPC različnih rastlin so ugotovili, da so pri enokaličnicah prisotni večinoma GIPC iz serije B s po tremi sladkorji, vezanimi na inozitol fosforilceramid, dvokaličnice pa večinoma vsebujejo GIPC iz serije A z dvema sladkornima enotama (Cacas s sod., 2013). Raznolikost GIPC je zelo visoka in podobna raznolikosti, ki jo poznamo pri živalskih gangliozidih, ki pri vretenčarjih obsegajo 190 različic (Yu s sod., 2011). Slika 6. Analiza GIPC, ekstrahiranih iz celične kulture tobaka BY-2 in listov tobaka. Vzorec GIPC so analizirali z masno spektroskopijo MALDI-TOF. Pri celični kulturi tobaka Bright Yellow-2 so našli vseh šest serij GIPC (zgoraj), medtem ko GIPC iz ekstrakta tobakovih listov sodijo v serijo A (spodaj). Slika prirejena po Cacas s sod.,

27 Maščobne kisline pri GIPC so izredno dolge, saj lahko nasičene verige vsebujejo tudi po 28 ogljikovih atomov. Izračunali so, da končni deli maščobne kisline iz zunanjega sloja membrane segajo v notranji del membrane in so z njim v kontaktu vsaj s šestimi ali sedmimi ogljikovimi atomi. Predvidevajo, da do te interakcije v resnici prihaja pri 40 % lipidov v plazmalemi (Gronnier s sod., 2016). Nedavno so na osnovi temeljitih analiz z masno spektroskopijo postavili model membrane tobaka (Cacas s sod., 2016). Ta predvideva močno obogatitev GIPC na apoplastni strani plazmaleme, fosfolipidov je tu malo, slednji se nahajajo predvsem na citosolni strani membrane. Sfingolipidi se skupaj s steroli združujejo v rafte. Acilni repi sfingolipidov se povezujejo z acilnimi repi lipidov v citoplazemskem sloju plazmaleme (Slika 7). Slika 7. Model organizacije lipidov v membrani tobaka. V zunanji membrani tobaka se nahajajo GIPC, na citosolni strani plazmaleme pa fosfolipidi. Za postavitev modela so uporabili eksperimentalne podatke o molarni sestavi lipidov (Furt s sod., 2010; Cacas s sod., 2016) ter podatke o asimetrični razporeditvi lipidov (Tjellstrom s sod., 2010). PIP 2, fosfatidilinozitol bifosfat; PS, fosfatidil serin; DGDG, digalaktozil diacilglicerol; SG, steril glikozidi; ASG, steril glikozidi z maščobno kislino; GlcCer, glikozilirani ceramid; GIPC, glikozil inozitol fosforilceramid. Slika prirejena po Cacas s sod., Od odkritja GIPC (Carter and Koob, 1969) je minilo že več kot 50 let, a je kljub temu šele zadnjih nekaj let malo več znanega o njihovi razporeditvi v celici, funkcije pa še vedno niso dobro opisane. Znano je, da so GIPC glavni sestavni element plazmaleme, tonoplasta in notranjih membran (Markham s sod., 2013). Nahajajo se v zunanji plasti plazmaleme, kjer vplivajo na integriteto membrane in prepustnost ionov (Cacas s sod., 2012a; Chao s 13

28 sod., 2011; Simon-Plas s sod., 2011; Tjellstrom s sod., 2010). Sestavljajo membranske mikrodomene in pritrjajo membrano na celično steno (Voxeur and Fry, 2014). Na GIPC je vezanih veliko proteinov, ki so ključni elementi v celični signalizaciji, nekaj pa je tudi dokazov, da GIPC služijo kot prekurzorji signalnih molekul. Poleg strukturne funkcije sodelujejo tudi v odgovoru na abiotske dejavnike (Dutilleul s sod., 2012) in v programirani celični smrti (Liang s sod., 2003; Shi s sod., 2007). Povezali so jih tudi s preobčutljivostnim odzivom, ki ga prožijo patogeni organizmi (Gan s sod., 2009; Liang s sod., 2003; Wang s sod., 2008) in interakcijami med patogeni in gostitelji (Peer s sod., 2010; Rivas-San Vicente s sod., 2013; Takahashi s sod., 2009). 2.4 SFINGOLIPIDI PRI KVASOVKAH Kvasovke so pogosto uporabljene kot modelni organizem za študij sfingolipidov, saj je lipidni metabolizem precej ohranjen med evkarionti in ker je gojenje kvasovk precej enostavno. Vsebujejo tri enostavne sfingolipide (Slika 8), ki so dobro opredeljeni: inozitol fosforilceramid IPC (ang. inositol phosphorylceramide), manozilinozitol fosforilceramid MIPC (ang. mannosylinositol phosphorylceramide) in manozildiinozitol fosforilceramid M(IP) 2 C (ang. mannosyldiinositol phosphorylceramide) (Ploier s sod., 2014; Yamagata s sod., 2013). IPC je prekurzor v sintezi MIPC in M(IP) 2 C. Slika 8. Sfingolipidi pri kvasovkah. Kvasovke vsebujejo tri tipe sfingolipidov, inozitol fosforilceramid IPC, manozilinozitol fosforilceramid MIPC in manozildiinozitol fosforilceramid M(IP) 2 C. Pri nastanku IPC je ključen encim Aur1, pri nastanku MIPC pa proteini Csg1, Csh1 in Csg2. Za nastanek M(IP) 2 C je ključen encim Ipt1. Kvasovke ne preživijo mutacije v genu AUR1, medtem ko MIPC in M(IP) 2 C nista ključna za življenjski cikel kvasovk. Slika je prirejena po Yamagata s sod., Sfingolipide pri kvasovkah sestavljajo dolgoverižna baza LCB, maščobna kislina in polarna glava, podobno kot pri rastlinah. Dva tipa LCB pri kvasovkah sta dihidrosfingozin DHS (=sfinganin) in 4-hidroksi dihidrosfingozin (=fitosfingozin). Sfinganin ima lahko 16, 18 ali 20 ogljikovih atomov, fitosfingozin pa 18 ali 20. Maščobna kislina ima 26 ogljikovih atomov, je nenasičena in ima eno ali dve hidroksilni skupini ali pa je brez hidroksilne skupine. Sinteza ceramidov poteka v endoplazmatskemu retikulumu, od tam pa se 14

29 prenesejo v Golgijev aparat, kjer se na ceramidno osnovo doda fosfatidilinozitol, da nastane IPC. Ta prenos katalizira IPC-sintaza, katero kodira gen AUR1 (Nagiec, 1997). Drugi kompleksni sfingolipid, MIPC, nastane s prenosom manoze iz GDP-manoze na hidroksilno skupino na drugem ogljikovem atomu inozitola. Ta reakcija zahteva prisotnost treh proteinov, Csg1 (Sur1) in Csg2 (Beeler s sod., 1997) ter Csh1 (Uemura s sod., 2003). Ti proteini tvorijo komplekse Csg1-Csg2 in Csh1-Csg2, kjer sta Csg1 in Csh1 encimski podenoti, Csg2 pa ima regulatorno funkcijo (Uemura s sod., 2003). Najkompleksnejši sfingolipid pri kvasovkah, M(IP) 2 C, nastane s prenosom drugega inozitol fosfata iz fosfatidilinozitola na MIPC. Reakcijo katalizira encim IPT1 (Dickson s sod., 1997). Mutacija, ki vodi v odsotnost gena AUR1, povzroči izgubo vseh treh sfingolipidov, česar kvasovke ne preživijo (Nagiec, 1997). Delecija gena CSG1 povzroči močno zmanjšano sintezo MIPC, medtem ko delecija gena CSH1 ne vpliva bistveno na MIPC (Uemura s sod., 2003). Delecija obeh genov vodi v popolno odsotnost MIPC, kljub temu kvasovke rastejo normalno. Mutacija v genu IPT1 (Dickson s sod., 1997) ravno tako ne vpliva na rast. 2.5 ŠKODLJIVCI IN NJIHOVO ZATIRANJE Bolezni, ki jih povzročajo rastlinski patogeni mikroorganizmi Varnost hrane je postala težava svetovne razsežnosti. Pogosto pride do porasta cene hrane zaradi razmahov rastlinskih bolezni. Bolezni, ki jih povzroča oomiceta Phytophthora, predstavljajo veliko grožnjo poljedelstvu in naravnim ekosistemom. V tem rodu je bilo opisanih preko 100 različnih vrst, ki so filogenetsko razporejene v 10 kladov (Érsek in Ribeiro, 2010). Prva opisana vrsta je bila P. infestans, ki je povzročila epidemijo krompirjeve plesni v letih na Irskem in posledično zasejala lakoto, množično odseljevanje in smrt med prebivalstvom. Bolezen se še vedno pojavlja epidemično tako na krompirju kot tudi paradižniku (Ristaino, 2002) (Slika 9). Ocenjujejo, da P. infestans letno povzroči za pet milijard $ izgub na svetovni ravni zaradi potrebne stalne kontrole nad oomiceto in dejanskih izgub pridelka (Haverkort s sod., 2009). Pojavljajo se vedno nove vrste in različice. Z obsežno prodajo različnih rastlin se ta rod hitro širi po vsem svetu in lahko okuži še neokužene in avtohtone vrste. Do sedaj so bili predstavniki družine NLP opisani pri šestih različnih vrstah iz tega rodu, P. capsici (Feng s sod., 2011), P. infestans (Haas s sod., 2009), P. megakarya (Bae s sod., 2005), P. ramourum (Haas s sod., 2009), P. parasitica (Fellbrich s sod., 2002) in P. sojae (Qutob s sod., 2002). Razpon gostiteljev je zelo širok, saj so to med drugimi krompir, soja, kakavovec in tobak, ki so v samem vrhu svetovne letne pridelave. Phytophthora lahko okuži liste, plodove, korenine in debla (Kroon s sod., 2012). 15

30 Slika 9. Krompirjeva in paradižnikova plesen. Znaki krompirjeve in paradižnikove plesni, ki jo je povzročila P. infestans na listu (A), steblu (B) in gomolju krompirja (C) ter na plodovih paradižnika (D) (Ristaino, 2002). Proteine iz družine NLP izločajo tudi druge oomicete, ki so rastlinski škodljivci, npr. Pythium aphanidermatum, ki povzroča zamrtje semen na raznih poljščinah (Veit s sod., 2001) ali H. arabidopsidis, ki povzroča peronosporo na A. thaliana (Preglednica 1) (Cabral s sod., 2012). Glive, pri katerih so potrdili proteine iz družine NLP, so npr. Botrytis cinerea, ki povzroča gnilobo na vinski trti (Schouten s sod., 2008), F. oxysporum in Verticilium dahlie, ki povzročata venenje mnogih poljščin (Érsek in Ribeiro, 2010; Zhou s sod., 2012), Moniliopththora perniciosa, ki je povzročiteljica bolezni na kakavovcu (Zaparoli s sod., 2011) in še nekatere druge. 16

31 Preglednica 1. Seznam patogenov s proteini NLP in bolezni, ki jih povzročajo. Vrsta Št. Bolezni Gostitelj Literatura NLP Bakterije Pectobacterium carotovorum 1 gniloba razne poljščine Mattinen s sod., 2004 Oomicete Hyaloperonspora arabidopsidis 12 peronospora A. thaliana Cabral s sod., 2012 Oomicete Phytophthora 18 rja, gniloba razhudnikovke Feng s sod., 2011 capsici Oomicete Phytophthora infestans 27 rja, gniloba razhudnikovke Haas s sod., 2009a Oomicete Phytophthora 9 počrneli plodovi kakavovec Bae s sod., 2005 megakarya Oomicete Phytophthora ramourum 59 poškodbe na hrastu drevesne vrste Haas s sod., 2009a Oomicete Phytophthora parasitica 1 gniloba razne poljščine Fellbrich s sod., 2002 Oomicete Phytophthora sojae 39 gniloba soja Qutob s sod., 2002 Oomicete Pythium 1 zamrtje semen razne poljščine Veit s sod., 2001 aphanidermatum Oomicete Pythium ultimum 7 zamrtje semen koruza, krompir, pšenica Lévesque s sod., 2010 Glive Botrytis cinerea 2 plesen, rja, gniloba vinska trta Schouten s sod., 2008 Glive Botrytis eliptica 2 rja, snet lilija Staats s sod., 2007 Glive Colletotrichum higginsianum 6 antraknoza A. thaliana Kleemann s sod., 2012 Glive Fusarium 1 venenje razne poljščine Bailey, 1995 oxysporum Glive Gibberella zeae 4 rja, snet pšenica, ječmen Bailey, 1995 Glive Magnaporthe oryzea 18 rja, snet riž, pšenica, ječmen Mogga s sod., 2016 Glive Mycosphaerella graminicola 1 rjava pegavost pšenica Motteram s sod., 2009 Glive Moniliopththora perniciosa 5 bolezen kakavovca kakavovec Garcia s sod., 2007 Glive Sclerotinia sclerotiorum 2 plesen, rja, snet poljščine Dallal Bashi s sod., 2010 Glive Verticillium dahlie 9 venenje poljščine Zhou s sod., 2012 Pridelki so izpostavljeni mnogim škodljivcem, ki lahko resno zmanjšajo donos, zato je uporaba kemikalij za zaščito pred raznimi škodljivci precejšnja. Najhujša bolezen, ki prizadene krompir, je krompirjeva plesen, ki lahko povzroči tudi do 16-% izgubo globalnega pridelka (Haverkort s sod., 2009). Trenutno ščitijo pridelek predvsem z uporabo tistih fungicidov, ki so lahko uspešni tudi proti sevom Phytophthore, ki so se 17

32 pojavili v zadnjih desetletjih in so sicer odporni proti mnogim fungicidom. Najpogosteje se za zatiranje Phytophthore uporabljajo preparati, ki vsebujejo učinkovino mankozeb. Mankozeb je ditiokarbamat, ki preventivno deluje proti mnogim rastlinskim boleznim. Poleg mankozeba se uporabljajo tudi preparati, ki vsebujejo baker v različnih oblikah (Cooke s sod., 2011) Male spojine za zatiranje rastlinskih bolezni Velja nekaj splošnih pravil, katerim morajo ustrezati spojine, da so sprejete kot sredstvo za zatiranje rastlinskih škodljivcev. Spojine morajo biti takšne, da lahko preidejo preko plazmaleme. Biti morajo selektivno toksične, da ni toksičnih efektov na samo rastlino. Ker preidejo v simplast patogenih organizmov, morajo biti dovolj odporne, da jih metabolni proteini ne uničijo. Ker so običajno uporabljene v pršilih, ki se jih poškropi po nasadih, morajo difundirati preko rastlinske kutikule. Običajno to dosežejo z dodatkom pomožnih snovi, ki omogočijo prehod preko kutikule. Efektivne spojine morajo biti tudi topne v vodi, kar je še posebej pomembno pri privzemu preko korenin ali za zaščito semen. Obstaja mnogo negativnih posledic pri uporabi fungicidov. Uporabniki hrane, pri kateri so bili med proizvodnjo le-te uporabljeni različni fungicidi, se bojijo toksičnih ostankov, poleg tega pa lahko med uporabo pride do kontaminacije zemlje in vode. Baker se pogosto uporablja za uničevanje rastlinskih patogenov. Je esencielni element, potreben v minimalnih količinah, ko pa se nahaja v prebitku, je lahko zelo nevaren predvsem za vodne in terestične organizme (Flemming in Trevors, 1989). Prevelika koncentracija bakra pri ljudeh povzroča tako bolečine v trebuhu, slabost, vrtenje, bruhanje in drisko ter tudi hujše simptome Ob dolgotrajnejšemu izpostavljanju se lahko pojavi tahikardija, notranje krvavitve in celo smrt (Stern s sod., 2007). Zato obstaja veliko povpraševanje po novih spojinah, ki bi tarčno delovale le na patogene mikroorganizme, ne pa na ostale mikroorganizme, rastline, živali ali celo ljudi. Proteini NLP se nahajajo pri taksonomsko raznovrstnih organizmih, ki pa so prisotni večinoma le pri rastlinskih škodljivcih in kot taki predstavljajo idealno tarčo za boj proti njim. Z usmerjenim napadom le na organizme, ki vsebujejo proteine NLP, bi lahko učinkovito selekcionirali in odstranili le škodljivce, hkrati pa bi zmanjšali vpliv na okolico Inhibitorji proteinov NLP Po našem vedenju so do sedaj le v eni študiji poročali o iskanju inhibitorjev proteinov NLP, ki bi zavirali nekrotično aktivnost proteinov. Testirali so spojine, ki so sicer znani zaviralci različnih procesov kot so endocitoza, nekrotična celična smrt in aktivnost proteinskih kinaz. Učinek najvišjih koncentracij spojin, ki same po sebi niso povzročale toksičnih učinkov, so preverili ob infiltraciji skupaj s proteini BcNEP1 in BcNEP2, ki ju sicer izloča Botrytis cinerea in proteinom NLP Pp. Od vseh inhibitorjev je edino dinazor (ang. dynasore), ki deluje kot inhibitor endocitoze, odvisne od dinamina, v koncentraciji 18

33 100 µm inhibiral 40 nm BcNEP1, medtem ko na višje koncentracije BcNEP1 ter na BcNEP2 in NLP Pp ni imel učinka (Cuesta Arenas s sod., 2010). Do sedaj še ni bilo opisanih malih molekul, ki bi učinkovito zavirale nekrotične lezije in druge posledice, ki jih imajo proteini NLP ob stiku z rastlinsko celico Detekcija toksinov, ki jih izločajo rastlinski škodljivci Blokada domnevnega vezavnega mesta na proteinih NLP z malimi molekulami bi bila lahko zelo dobrodošlo orodje pri zatiranju patogenih organizmov, ki izločajo proteine NLP. Številčnost ljudi na svetu narašča, zato je proizvodnja hrane in zagotavljanje kvalitete le-te ključnega pomena. Večino predstavnikov iz družine NLP izločajo glive in oomicete, ki so pomembno vplivale na potek zgodovine. V zadnjih letih se s pospešeno hitrostjo razvijajo senzorji za določanje toksinov, ki temeljijo na različnih pristopih. Senzorji, ki temeljijo na osnovi površinske plazmonske resonance (SPR, ang. surface plasmon resonance) so zelo pripravni, saj običajno omogočajo hitro določanje molekul tudi v zelo nizkih, femtomolarnih koncentracijah in brez potrebne predhodne priprave vzorcev. Veliko takšnih senzorjev je prenosnih, poceni in enostavnih za uporabo. 19

34 3 NAMEN DELA IN HIPOTEZE Osnovni namen doktorskega dela je bil proučiti vezavo proteinov NLP na umetne lipidne membrane in celične membrane rastlinskih celic in ugotoviti vrste poškodb, ki jih povzročajo. Hipoteza 1: Proteini NLP prepoznavajo specifični lipid ali kombinacijo lipidov v plazmalemi dvokaličnic. Specifični cilji doktorske naloge so: - določiti molekulo, preko katere se proteini NLP vežejo na plazmalemo gostitelja; - opredeliti vezavo med različnimi NLP-ji in tarčno molekulo; - raziskati, kakšne poškodbe povzročijo proteini NLP na lipidnih veziklih. Blokada domnevnega vezavnega mesta na proteinih NLP z malimi molekulami bi bila zelo dobrodošlo orodje pri zatiranju patogenih organizmov, ki izločajo proteine NLP. Proizvodnja hrane in zagotavljanje kvalitete le-te ob stalnem naraščanju števila ljudi je ključnega pomena. Tekom doktorske naloge smo uvedli še novo hipotezo, saj smo želeli poiskati spojino ali več njih, ki bi se izkazala kot učinkovita v zaviranju delovanja proteinov NLP. Hipoteza 2: S testiranjem knjižnice malih spojin bomo poiskali eno ali več malih molekul, ki bodo zmanjšale nekrotično aktivnost proteinov NLP. 20

35 4 MATERIALI IN METODE 4.1 MATERIALI Kemikalije Uporabljali smo kemikalije proizvajalcev Sigma-Aldrich (ZDA) ali Merck (Nemčija), če ni drugače zapisano Kvasovke Uporabljali smo običajni sev kvasovke Saccharomyces cerevisiae z oznako BY4741 (genotip: MATa his3 1 leu2 0 met15 0 ura3 0, Brachmann s sod., 1998), iz katere smo ekstrahirali sfingolipide z oznako BY in mutiran sev S. cerevisiae z oznako MYY89 (genotip BY4741, csg1 ::natnt2 csh1 ::LEU2, Yamagata s sod., 2013), iz katerih smo pripravili sfingolipide z oznako MYY (Yamagata s sod., 2013). Seve kvasovk smo pridobili pri prof. Toshihide Kobayashi (Riken, Japonska) Tobak Uporabljali smo tobak Nicotiana tabacum White Burley v starosti 5-7 tednov, ki smo ga pridobili pri Špeli Prijatelj Novak (Nacionalni inštitut za biologijo, Slovenija) Proteini Uporabljali smo protein NLP Pp, ki ga je pridobila Isabell Albert (ZMBP, Zentrum für Molekularbiologie der Pflanzen, Nemčija) z izražanjem v Pichii pastoris ter NLP Pya in HaNLP3, ki ju je pridobila Tea Lenarčič (KI, Slovenija). NLP Pya je bil izražen v Escherichii coli, HaNLP3 pa v P. pastoris (Preglednica 2). Preglednica 2. Seznam proteinov, ki smo jih uporabili v nalogi. Protein Organizem, ki ga izloča Izražen v Pridobila NLP Pp Phytophthora parasitica Pichia pastoris Isabell Albert, ZMBP NLP Pya Pythium aphanidermatum Escherichia coli Tea Lenarčič, KI HaNLP3 Hyaloperonospora arabidopsidis Escherichia coli Tea Lenarčič, KI Protitelesa Protitelesa primarna kunčja protitelesa proti NLP Pp sekundarna kozja antikunčja protitelesa, označena s hrenovo peroksidazo Dobavitelj Isabell Albert, ZMBP Santa Cruz, sc

36 4.1.6 Lipidi Sfingomielin iz govejih možganov (SM), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (POPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholinom (DOPC), holesterol in D-eritro-sfingozil fosfoinozitol (lizo-ipc) smo kupili pri Avanti Polar Lipids (ZDA). Fitosfingozin in gangliozide iz govejih možganov smo kupili pri Sigma Aldrich, ZDA Raztopine in gojišča Gojišča za kvasovke Eksperiment Ekstrakcija sfingolipidov Priprava protoplastov Gojišče minimalno gojišče za gojenje kvasovk: SD/-Trp Broth, Clontech 1 % kvasni ekstrakt, 2 % pepton, 2 % dekstroza, 2 % agar Topila za ekstrakcijo lipidov Vsa topila v nadaljevanju smo pripravili v prostorninskih razmerjih (vol : vol). Lipidi Topila celotni lipidi iz tobaka kloroform : metanol = 2 : 1 GIPC iz tobaka 70 % etanol z 0,1 N HCl sfingolipidi iz kvasovk etanol : voda : dietileter : piridin : NH 4 OH = 15 : 15 : 5 : 1 : 0, Topila za shranjevanje lipidov Lipidi Topila celotni lipidi iz tobaka kloroform : metanol = 2 : 1 GIPC iz tobaka THF : metanol : voda = 4 : 4 : 1 z 0,1 % mravljično kislino sfingolipidi iz kvasovk kloroform : metanol : voda = 16 : 16 : Mobilne faze za razvoj lipidov na ploščah TLC Lipidi Topila celotni lipidi iz tobaka kloroform : metanol : 4,7 M NH 4 OH = 9 : 7 : 2 GIPC iz tobaka kloroform : metanol : 4,7 M NH 4 OH = 9 : 7 : 2 sfingolipidi iz kvasovk kloroform : metanol : 2 M NH 4 OH = 65 : 25 : 4 22

37 Detekcijska mešanica za razvoj lipidov na plošči TLC Lipidi Mešanica 1 Mešanica 2 Mešanica 3 celotni lipidi 10 % CuSO 4 z 0,05 % primulin v aceton : voda = 8 : 2 iz tobaka 8 % H 3 PO 4 GIPC iz tobaka 10 % CuSO 4 z 8 % H 3 PO 4 0,05 % primulin v aceton : voda = 8 : 2 2 % orcinol v 11,4 % H 2 SO 4 sfingolipidi iz kvasovk 10 % CuSO 4 z 8 % H 3 PO 4 0,05 % primulin v aceton : voda = 8 : METODE Gojenje rastlin Nicotiana tabacum Rastline tobaka smo gojili 5-7 tednov pri temperaturi 20 C v temi in pri 22 C na svetlobi, osvetlitvi µmm -2 s -1, fotoperiodi 16 ur svetlobe in 8 ur teme in relativni vlažnosti zraka 75 ± 2 %. Za osvetlitev so bile uporabljene žarnice Osram L36W/ Odstranitev kloroplastov in ekstrakcija celotnih lipidov iz tobaka Z rastline tobaka smo odrezali 50 g listov, jih prenesli v terilnico ter jim dodali 50 ml hladnega pufra CIB (0,6 M sorbitol, 10 mm MgCl 2, 10 mm EGTA (etilen glikol-bis(βaminoetil eter)-n,n,n',n'-tetraocetna kislina), 10 mm EDTA, 40 mm HEPES (4-(2- hidroksietil)piperazin-1-etansulfonska kislina), 20 mm NaHCO 3, ph uravnan s KOH do 8,0). Liste smo dobro strli, dodali še približno 10 ml pufra CIB in nato homogenat filtrirali preko petih plasti gaze. Filtrat smo prenesli v dve centrifugirki in centrifugirali (5 min, x g, 4 C). Usedlino smo raztopili v nekaj ml pufra CIB in ga prenesli na prej pripravljen gradient Percolla, ki smo ga pripravili s centrifugiranjem mešanice 13 ml Percolla, 13 ml dvakratnega pufra CIB in dodatkom 15,4 mg (2 mm) glutationa (30 min, x g, 4 C). Frakcije smo pridobili s centrifugiranjem 12 minut pri x g in 4 C. Po centrifugiranju smo frakcije, ki so vsebovale po 2 ml, pobirali od vrha proti dnu; zgornjo, temno zeleno obarvano frakcijo smo zavrgli, ostale označili s črkami A-F in jih uporabili za ekstrakcijo lipidov. Vsaki frakciji smo dodali enak volumen mešanice kloroform : metanol = 2 : 1 in ekstrahirali preko noči ob stalnem stresanju pri sobni temperaturi. Naslednje jutro smo spodnjo plast prenesli v stekleno bučko in sušili lipide na rotavaporju 4 ure. Bučke smo prepihali z dušikom, jih pokrili s parafilmom in shranili pri -20 C. 23

38 4.2.3 Gojenje kvasovk za izolacijo sfingolipidov in ekstrakcija sfingolipidov iz kvasovk Kvasovke smo iz trdnega gojišča prenesli z zobotrebcem v 3 ml tekočega gojišča minimalnega gojišča za kvasovke (SD-Trp, Clonetech) in kulturo inkubirali 24 h na 30 C s stalnim stresanjem. Nato smo prenesli 2 ml začetne kulture v 250 ml gojišča, kateremu smo dodali triptofan (20 mg/ml) in kulturo ponovno stresali 24 h pri 30 C. Tekoče gojišče s kvasovkami smo centrifugirali (10 min, vrt./min, 4 C), usedlini dodali MQ-vodo ter ponovno centrifugirali (10 min, vrt./min, 4 C). Nato smo usedlini dodali 40 ml 5 % triklorocetne kisline, premešali in inkubirali 20 min pri 4 C. Po centrifugiranju (10 min, vrt./min, 4 C) smo usedlini dodali 24 ml ekstrakcijske mešanice (etanol : voda : dietileter : piridin : NH 4 OH = 15 : 15 : 5 : 1 : 0,018) ter jo inkubirali 15 min pri 60 C. Supernatant smo spravili, usedlino po centrifugiranju (10 min, vrt./min, 25 C) pa ponovno ekstrahirali v 6-ih ml ekstrakcijske mešanice in centrifugirali pri enakih pogojih ter združili oba supernatanta. Fosfolipide smo odstranili z alkalno metanolizo lipidnega vzorca. Lipide smo posušili na rotavaporju do suhega, jim dodali 1 ml 0,1 N KOH-MeOH, inkubirali 2 h pri 40 C, dodali 150 µl HCl, 1,5 ml heksana in tri kapljice MQ-vode. Po centrifugiranju te mešanice (5 min, vrt./min, 25 C) smo shranili spodnjo fazo, preostanku v bučki dodali 1,5 ml heksana in ponovno centrifugirali in zopet shranili spodnjo fazo ter vse skupaj posušili na rotavaporju. Lipide smo nato ločili po Folchu (Folch s sod., 1957). Raztopili smo jih v mešanici 2 ml kloroforma, 1 ml metanola in 0,75 ml MQ-vode. Po centrifugiranju (5 min, vrt./min, 25 C) smo zbrali spodnjo fazo, jo posušili in lipide raztopili v mešanici za sfingolipide kvasovk (kloroform : metanol : voda = 16 : 16 : 5) in jih do uporabe shranili pri -20 C Tankoplastna kromatografija (TLC) Tankoplastno kromatografijo (TLC, ang. thin-layer chromatography) smo izvajali na ploščah HPTLC (Merck). Ploščo smo ustrezno označili in jo dobro osušili na grelniku (30 min na 120 C). V kadičko za TLC smo dali filtrirni papir, nalili nekaj ml mobilne faze za TLC in tako dvakrat sprali. Nato smo nalili svežo mobilno fazo do višine 1 cm. Kadičko smo pokrili in jo pustili pokrito vsaj pol ure pred razvijanjem plošče. Segreto ploščo za TLC smo prestavili na aluminijasto folijo, jo pokrili s čistim stekelcem in ohladili. Ob nanašanju lipidov smo jo stalno prepihovali s fenom. Na suho ploščo smo nanašali po 50 ng lipidov. Po nanosu smo ploščo postavili v komoro za TLC in komoro pokrili. Ločitev je tipično trajala min. Ploščo smo vzeli iz kadičke, ko je bila fronta cca. 1 cm pod zgornjim robom. Ploščo smo posušili in lipide detektirali z ustrezno detekcijsko mešanico. 24

39 4.2.5 Detekcija lipidov na plošči TLC Uporabljali smo tri različne sisteme za detekcijo lipidov na plošči TLC. Vse plošče smo po razvitju dobro osušili s fenom, nato pa smo jih poškropili z mešanico 10 % bakrovega sulfata in 8 % fosforne kisline ali 2 % orcinolom in jo segrevali pri 110 C pet minut oz. do pojava ustreznih lipidnih lis. V primeru, da smo lipide določevali z raztopino primulina, smo ploščo po škropljenju brez segrevanja pogledali pod UV-lučko Obogatitev lipidov iz frakcije F in njihova frakcionacija Lipide iz frakcije, na katero se je vezal protein NLP Pp, smo želeli obogatiti, zato smo jih nanesli v petih nanosih na ploščo TLC in po razvitju v kadički postrgali želena področja s plošče glede na prvi nanos, ki smo ga barvali z mešanico 10 % CuSO 4 z 8 % H 3 PO 4 (Slika 10). Lipide smo ekstrahirali v mešanici kloroform : metanol : voda = 2 : 2 : 0,625, centrifugirali, posušili supernatant in ga raztopili v mešanici za sfingolipide (kloroform : metanol : voda = 16 : 16 : 5) ter uporabili za prenos na poliviniliden fluoridno membrano (PVDF). Slika 10. Obogatitev lipidov iz frakcije F. Lipide iz frakcije F smo nanesli šestkrat na ploščo TLC, jih razvili v mešanici kloroform : metanol : 4,7 M NH 4 OH = 9 : 7 : 2, pobarvali en nanos in postrgali silikagel v treh podfrakcijah ustrezno glede na del plošče, kjer smo lipide pobarvali z mešanico 10 % bakrovega sulfata in 8 % fosforne kisline. 25

40 4.2.7 NaDS-PAGE in odtis western Poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS- PAGE) smo izvedli z 12 % zamreženim gelom in elektroforeznim sistemom Mini-Protean II po navodilih proizvajalca (BioRad, ZDA). Proteine v gelu smo barvali z modrim barvilom Coomassie Brilliant Blue. Po ločbi z NaDS-PAGE smo proteine prenesli z gela z mokrim prenosom po navodilih proizvajalca na membrano PVDF Immobilion-P (Millipore, ZDA) z aparatom Mini Trans-Blot (BioRad, ZDA) pri 150 ma, oziroma 300 ma, 90 min. Po koncu prenosa smo membrano stresali preko noči pri 4 C v pufru za blokado (4 % BSA, 10 mm Tris-HCl, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA, ph 7,4). Naslednji dan smo membrano inkubirali 2 uri s primarnimi kunčjimi monoklonskimi protitelesi proti NLP Pp, redčenimi v pufru za blokado (1 : 500). Po 3-x spiranju po 10 min s pufrom za spiranje (10 mm Tris-HCl, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA, ph 7,4) smo membrano inkubirali 2 uri s sekundarnimi kozjimi antikunčjimi protitelesi, označenimi s hrenovo peroksidazo v pufru za blokado (1 : 1.000). Po spiranju s pufrom za spiranje (3 x 10 min) smo dodali peroksidazni substrat za kolorimetrično detekcijo proteinskih lis. V 25 ml pufra za razvijanje membran (5 mm Tris-HCl, 140 mm NaCl, 1 mm Na 2 HPO 4 ) smo dodali 15 mg 4-kloro-1-naftola, 5 ml metanola in 50 μl H 2 O 2 in po parih minutah stresanja membrane v pripravljeni mešanici ocenili nastanek lis. Inkubacije in spiranja so potekala na stresalniku pri sobni temperaturi (razen v primeru stresanja čez noč pri 4 C) Prenos lipidov na membrano PVDF (ang. TLC-blotting) Ploščo TLC smo razvili enako kot v poglavju 4.2.4, le da smo nanesli dvojno maso lipidov (100 ng). Ploščo TLC smo po razvitju v komori sušili s fenom cca min, nato pa še eno uro v desikatorju. Za prenos lipidov na membrano PVDF smo uporabljali aparaturo ATTO (180 C) ali vroč likalnik (maksimalna temperatura). Membrane smo zložili v sledečem vrtnem redu: na dnu je bil stekleni filter (ATTO, AC-5972), nato plošča HPTLC, membrana PVDF (ATTO, AC5973), politetrafluoroetilenska membrana (ATTO, AE-6665) in še en stekleni filter na vrhu. Preden smo priložili membrano PVDF, smo jo 30 s namakali v aktivacijski mešanici (106 mg CaCl 2 x 2H 2 0, 40 ml H 2 O, 14 ml MeOH, 80 ml 2-propanol). Vse skupaj smo prenesli v aparaturo za prenos za 30 sekund ali pa smo jih za enak čas stisnili z likalnikom, segretim na največjo stopnjo. Po prenosu smo preostanek lipidov na plošči TLC detektirali z mešanico 10 % bakrovega sulfata in 8 % fosforne kisline, membrano PVDF pa smo stresali v raztopini 5 % BSA v PBS (10 mm Na 2 HPO4, 1,8 mm KH 2 PO 4, 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, ph 7,4) preko noči pri 4 C. Naslednji dan smo membrano najprej dve uri inkubirali v raztopini 5 % BSA v PBS, kateri smo dodali 10 µg/ml proteina NLP Pp ali NLP Pya. Sledila je inkubacija v 5 % BSA v PBS s 26

41 primarnimi kunčjimi protitelesi antinlp Pp (1 : 1.000) in kasneje v 5 % BSA v PBS s sekundarnimi mišjimi antikunčjimi protitelesi, označenimi s hrenovo peroksidazo (1 : 1000). Med in po posamezni inkubaciji smo membrano spirali trikrat po 10 min v pufru TBS (50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, ph 7,5). Po zadnjem spiranju smo vezana sekundarna protitelesa detektirali, kot je opisano v poglavju Celoten postopek je potekal pri sobni temperaturi (Slika 11). Slika 11. Prenos lipidov iz plošče HPTLC na membrano PVDF. Z uporabo prenosa lipidov iz plošče HPTLC na membrano PVDF smo detektirali vezavo proteina na posamezni lipid Detekcija proteinov po prenosu na membrano PVDF Detekcija s kitom Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent Raztopini A in B iz kita Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) smo zmešali v razmerju 1 : 1. Z membrane PVDF smo po zadnjem spiranju v pufru TBS popivnali preostali pufer in nanjo kanili 2 ml mešanice reagentov A in B. Po 2- minutni inkubaciji smo membrano prenesli na svežo folijo in pomerili kemiluminescenco z aparaturo ImageQuant LAS 4000 Mini Detekcija z vodikovim peroksidom Natehtali smo 15 mg 4-kloro-1-naftola in ga raztopili v 5 ml metanola. Raztopljeni naftol 27

42 smo dodali v 25 ml pufra za razvijanje (25 mm Tris, 140 mm NaCl, 1 mm Na 2 HPO 4 ). Mešanici smo dodali 50 µl H 2 O 2 in vanjo potopili membrano PVDF. Po potrebi smo dodali še µl H 2 O 2. Označene proteine na membrani smo fotografirali Priprava večslojnih veziklov (MLV) Iz kvasnih sfingolipidov smo pripravili večslojne vezikle (MLV, ang. multilamellar vesicles). V stekleno bučko smo prenesli 0,5 mg sfingolipidov kvasovk BY ali MYY, raztopljenih v kloroform : metanol : voda = 16 : 16 : 5 in dodali nekaj ml mešanice kloroform : metanol = 2 : 1. Lipide smo sušili z uporabo rotavaporja štiri ure. Nastalemu lipidnemu filmu smo dodali steklene kroglice in 330 µl pufra MES (20 mm MES (2-(Nmorfolino) etansulfonska kislina), 140 mm NaCl, ph 5,8) ter krožno mešali eno minuto, da smo dobili suspenzijo MLV. Vezikle smo prepihali z dušikom in jih do uporabe shranjevali pri -20 C Priprava malih enoslojnih/unilamelarnih veziklov (SUV) SUV smo pripravili s sonikacijo MLV. Sonicirali smo pri 40 % amplitudi v ledeno-vodni kopeli po 10 s z 10 s premori, skupno 30 min. Po sonikaciji smo vzorec 45 min inkubirali v vodni kopeli pri 40 C in nato vezikle centrifugirali 5 min pri x g. SUV smo hranili na sobni temperaturi in jih uporabili na dan priprave Merjenje vezave proteina NLP Pya na vezikle z metodo SPR Za merjenje interakcij med proteinom NLP Pya in vezikli smo uporabili površinsko plazmonsko resonanco (SPR, ang. surface plasmon resonance), senzorski čip Series S L1 in aparaturo Biacore T100 (GE Healthcare). Čip smo najprej sprali z nosilnim pufrom (20 mm MES, 150 mm NaCl, ph 5,8) in ga nato regenerirali z dvema 1-minutnima pulzoma 40 mm oktil β-d-glukopiranozida (OG) in nato pri počasnem pretoku (2 µl/min) 10 min nanašali SUV BY ali MYY s koncentracijo 0,15 mg/ml preko druge pretočne celice (Fc2, ang. flow cell 2). NLP Pya smo injicirali preko obeh pretočnih celic v koncentracijah 0, 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5 in 10 µm. Po vsaki koncentraciji smo protein in lipide sprali s površine čipa z dvema 1-minutnima pulzoma 40 mm OG. Pretok je bil vseskozi 10 µl/min z izjemo nalaganja veziklov. Eksperimenti so potekali pri 25 C Imobilizacija proteinov NLP na senzorski čip Uporabili smo aparaturo Biacore T100, opremljeno s senzorskim čipom Series S CM5 (GE Healthcare), ki smo ga najprej sprali s pufrom za imobilizacijo (20 mm HEPES, 140 mm NaCl, ph 7,4). NLP Pp smo imobilizirali kovalentno preko aminskih skupin na karboksiliran dekstranski matriks na površini čipa s pomočjo kompleta za imobilizacijo (Amine coupling kit, GE Healthcare). Površino dveh pretočnih celic smo aktivirali z 10- minutnim pulzom mešanice 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorid 28

43 Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami. (EDC) : N-hidroksisukcinimida (NHS) = 1 : 1. Prvo pretočno celico smo pustili prazno za kontrolo nespecifične vezave lipidov na površino čipa, na drugo celico pa smo nanesli protein NLP Pp ali NLP Pya, odvisno od eksperimenta. Protein smo pred nanosom redčili do koncentracije 0,1 mg/ml v 10 mm natrijevemu acetatu. ph vrednost natrijevega acetata smo umerili na vrednost, ki je bila eno enoto pod izoelektrično točko proteina, da smo zagotovili, da je bil protein ob imobilizaciji pozitivno nabit. S tem smo zagotovili dovolj velik elektronski privlak z negativno nabito površino čipa. Obe celici smo po vezavi proteina blokirali s 7-minutnim vbrizganjem 1,0 M etanolamina-hcl, ph 8,0. Imobilizacija je potekala pri pretoku 10 µl/min in sobni temperaturi (Slika 12) EDC/NHS protein etanolamin Čas (s) Slika 12. Primer imobilizacije proteina NLP Pp preko aminskih skupin na senzorski čip CM5. Površino čipa smo najprej z mešanico EDC : NHS = 1 : 1. Na drugo pretočno celico smo nanesli RU z dvema vbrizgoma 0,1 mg/ml NLP Pp in obe celici blokirali z etanolaminom. Prikazujemo odziv na pretočni celici Merjenje vezave sfingolipidov na protein NLP Pp z metodo SPR Po imobilizaciji smo čip sprali z 20 mm MES, 150 mm NaCl, ph 5,8. Testirali smo 6 različnih vzorcev, kot je to razvidno v preglednici spodaj (Preglednica 3). Lipide smo redčili v nosilnem pufru in jih injicirali tri minute ter opazovali disociacijo naslednje tri minute. Za odštevanje prispevka topila smo pri enakih pogojih injicirali 200-x oz. 100-x v nosilnem pufru redčeno topilo, v katerem so bili raztopljeni lipidi. Površino smo regenerirali s 24- in 30-sekundnim pulzom 0,07 % Na-DS. Celoten eksperiment smo izvedli pri 25 C in pretoku 10 µl/min. 29

44 Preglednica 3. Vzorci lipidov za test vezave na NLP Pp s SPR. Lipidi Izvor lipidov Koncentracija Topilo (mg/ml) GIPC A. thaliana neznana kloroform : etanol : amonij : H 2 O = 10 : 60 : 6 : 24 GIPC cvetača neznana kloroform : etanol : amonij : H 2 O = 10 : 60 : 6 : 24 sfingolipidi BY kvasovke neznana kloroform : metanol = 16 : 16 : 5 sfingolipidi MYY kvasovke neznana kloroform : metanol = 16 : 16 : 5 SM goveji možgani 0,25 kloroform : metanol = 2 : 1 POPC sintetični 0,25 kloroform : metanol = 2 : Gojenje kvasovk za pripravo protoplastov Kvasovke BY4741 smo precepili iz trdnega gojišča v 100 ml tekočega gojišča YPD in jih gojili preko noči pri 30 C. Naslednje jutro smo pomerili optično gostoto (OD) in kvasovke redčili v svežem gojišču ter gojili do OD = 0, Priprava protoplastov kvasovk Kulturo kvasovk s pomerjenim OD = 0,3 smo centrifugirali (10 min, x g, 25 C), usedlini dodali sterilno MQ-vodo, ponovno centrifugirali (5 min, x g, 25 C) in nato usedlini dodali 1 M sorbitol, 25 mm etilendiamintetraocetno kislino (EDTA), 50 mm ditiotreitol (DTT), ph 8,0 ter ponovno centrifugirali (5 min, x g, 25 C). Usedlini smo dodali 1 M sorbitol in zopet odstranili supernatant s centrifugiranjem (5 min, x g, 25 C). Celice smo resuspendirali v citratnem pufru (10 mm Na-citrat, 1 M sorbitol, 1 mm EDTA, ph 5,8). Desetkrat redčenim kvasovkam v 1 M sorbitolu smo dodali 5 % NaDS, tako da je bila končna koncentracija detergenta 2 %. Pomerili smo absorbcijo pri 800 nm, kar nam je predstavljalo vzorec s 100 % kvasovk in 0 % protoplastov. Nato smo dodali kvasovkam encim litikazo (Sigma Aldrich) v koncentraciji 0,5 U/ml in jih inkubirali pri 30 C. V 5- ali 10-minutnih intervalih smo odvzeli vzorec, mu dodali 1 M sorbitol in detergent in znova pomerili OD pri 800 nm. Po 40-ih minutah smo pridobili vzorec, ki je imel 52 % protoplastov in inkubacijo z litikazo smo zaključili Označevanje proteinov Protein NLP Pya in HaNLP3 smo označili z Alexa Fluor 488 NHS Ester (Molecular Probes) po navodilih proizvajalca. 90-im µl proteina s koncentracijo 20 mg/ml smo dodali 9 µl 1 M bikarbonata ph 8,3. 0,8 mg barvila Alexa488 NHS Ester smo raztopili v 80 µl dimetil sulfoksida (DMSO) in 10 µl raztopljenega barvila počasi dodajali k proteinu z vmesnim mešanjem. Mešanico smo inkubirali eno uro v temi pri sobni temperaturi. Po inkubaciji smo odvečno barvilo odstranili s centrifugiranjem označenega proteina na kolonah Micro 30

45 Bio-Spin 6 (BioRad). Koncentracijo označenega proteina smo določili z merjenjem absorbance pri 280 nm in 517 nm in izračunom po navodilih proizvajalca Vezava NLP Pya na protoplaste kvasovk - konfokalna mikroskopija in pretočna citometrija 10 µl 100 µm proteina Alexa488-NLP Pya oz. Alexa488-HaNLP3 smo inkubirali dve minuti z 10 µl vzorca protoplastov oz. kvasovk. Mešanico smo centrifugirali (3 min, 800 x g, 4 C), odpipetirali supernatant in usedlini dodali 50 µl citratnega pufra, ponovno centrifugirali (3 min, 800 x g, 4 C), usedlini dodali 20 µl citratnega pufra in vzorce pregledali s konfokalnim mikroskopom in pretočnim citometrom. Slike so bile posnete s konfokalnim mikroskopom Leica TCS SP5 z imerzijskim objektivom pri 63-kratni povečavi (numerična apertura 1,4). Fluorescenčno označena proteina smo vzbujali pri 488 nm. Emisijo smo spremljali med 532 in 561 nm. Protoplaste in kvasovke smo najprej opazovali v svetlem polju. Vezavo fluorescenčno označenih proteinov smo opazovali tudi z uporabo pretočne citometrije (CyFlow, Partec). Rezultate smo obdelali s programom Flow Jo (Tree Star) Študij vezave inozitol fosfatov na NLP Pp z metodo SPR Čip Series S CM5 smo sprali z nosilnim pufrom (20 mm HEPES, 150 mm NaCl, ph 7,7) in kovalentno imobilizirali protein NLP Pp z imobilizacijskim nivojem R imm = RU. Testirali smo vezavo inozitol-1,3-p in inozitol-1,5-p v koncentracijah 0, 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1000 in 2000 µm. Dolžina asociacije je bila 60 s, disociacije 120 s, vezavo pa smo spremljali pri pretoku 5 µl/min in sobni temperaturi. Za regeneracijo je zadoščalo 30 s 1 M NaCl pri istem pretoku Študij vezave sladkorjev na NLP z metodo SPR Z Biacore T100 smo testirali vezavo sladkorjev na protein NLP Pya. Sprva smo v nosilnem pufru (20 mm MES, 150 mm NaCl, ph 5,8) testirali 26 sladkorjev pri koncentracijah 0, 0,1 in 1 mm (Preglednica 7). Tiste sladkorje, ki so se vezali, pa smo nadalje testirali v koncentracijah 0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 in 1 mm. Protein NLP Pya smo imobilizirali na drugo celico senzorskega čipa Series S CM7 preko aminskih skupin. Nivo imobilizacije proteina je bil RU. Vsak sladkor smo injicirali eno minuto in opazovali disociacijo še naslednji dve minuti pri pretoku 30 µl/min in sobni temperaturi. Regeneracija ni bila potrebna. Rezultate vezave sladkorjev, ki smo jih titrirali, smo prilegali modelu vezave dinamičnega ravnotežja s programom Biacore T100 Evaluation software (GE Healthcare). 31

46 Študij vezave glikozidov na NLP Pp z metodo SPR Za spremljanje interakcije glikozidov na NLP Pp smo čip imobilizirali s proteinom NLP Pp (R imm = RU). Čip smo sprali z nosilnim pufrom (20 mm MES, 150 mm NaCl, 3,3 % DMSO, ph 5,8) in titrirali glikozide, ki so jih pripravili v skupini prof. Marka Anderluha s Fakultete za farmacijo (FFA) (Preglednica 4). Glikozide AAA-10, AAA-12, AAA-13, AAA-9e in ANH6 smo titrirali pri koncentracijah 0, 1, 1,25, 2, 2,5, 4, 5, 8 in 10 mm. Spojino AAA-11 smo zaradi slabše topnosti titrirali pri koncentracijah 0, 0,125, 0,25, 0,5, 1 in 2 mm. Asociacijo in disociacijo smo spremljali 60 s pri pretoku 30 µl/min. Regeneracija ni bila potrebna, pred vsakim vbrizganjem pa smo pustili dodatne pol minute pretoka nosilnega pufra. Preglednica 4. Seznam glikozidov. Ime Shema Molekulska masa (Da) AAA ,262 AAA ,289 AAA ,315 AAA ,299 AAA-9e 278,342 ANH-6 301,249 32

47 Izbor spojin iz baze spojin Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani Pripravili smo spojine iz baze spojin FFA, ki so jo pripravili v skupini prof. Stanislava Gobca. Njihova knjižnica sestoji iz unikatnih in komercialno večinoma nedostopnih spojin. Izbrali smo 587 spojin, ki ustrezajo naslednjim fizikalno-kemijskim lastnostim in imajo zaradi le-teh potencial za dobro farmacevtsko učinkovino: porazdelitveni koeficient logp < 5 molekulska masa < 300 število donorjev vodikove vezi < 5 število akceptorjev vodikove vezi < 10 približno 1/3 spojin je imela maso < 300 Da Analiza spojin Spojine 6G7, 6E11, Nov.03 in Nov.18 smo naročili pri Enamine, spojine 5B7, 5D6 in 5D11 pri ChemBridge, spojino 6C3 pri Vitas-M Laboratory in spojino Nov.25 pri Fluorochem. Spojino 7C8 je sintetiziral Izidor Sosič s FFA. Izidor Sosič je spojinam tudi določil njihovo čistost z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC, ang. high performance liquid chromatography). Čistost vseh spojin je bila vsaj 95 % (Preglednica 5). Preglednica 5. Čistost spojin. Oznaka Ime Čistost (%) 7C8 2-(2-(1H-indol-3-il)acetamido)fenetil 2-(1H-indol-3-il)acetat 96,98 6C3 (4R)-2-(6-metil-4-okso-4H-kromen-3-il)tiazolidin-4-karboksilna kislina 96,95 6G7 2-((4-metoksifenil)amino)benzojska kislina 99,39 Nov.03 2-(p-tolilamino)benzojska kislina 97,68 Nov.25 2-((3-fluorofenil)amino)benzojska kislina 95,28 Nov.18 2-((2,5-dimetilfenil)amino)-3,5-dinitrobenzojska kislina 99,64 6E11 2-metil-5-((1S,2R,3R)-1,2,3,4-tetrahidroksibutil)furan-3-karboksilna kislina 99, Test vezave malih spojin na protein NLP Pya z metodo SPR Imobilizirali smo protein NLP Pya. Nanesli smo RU NLP Pya. Po imobilizaciji smo površino sprali z nosilnim pufrom (20 mm MES, 150 mm NaCl, 5 % DMSO, ph 5,8), v katerem smo testirali vezavo spojin. Spojine so bile raztopine v 100 % DMSO in tik pred eksperimentom ustrezno redčene v pufru brez DMSO tako, da so ob vbrizganju vsebovale 5 % DMSO. Male molekule iz baze spojin FFA smo testirali pri koncentracijah 0, 20 µm in 200 µm. Čas asociacije in disociacije pri obeh testiranjih je bil eno minuto, pri pretoku 33

48 30 µl/min. Regeneracija ni bila potrebna, smo pa med vsakim pulzom analita omogočili še dodatni dve minuti spiranja površine s pufrom. Vsi eksperimenti so potekali pri 25 C Testi toksičnosti spojin na celicah Caco-2 Celice Caco-2 z gostoto celic/ml smo nasadili v jamice na mikrotitrni plošči s 96 jamicami. V vsako jamico smo dali po 50 µl celične suspenzije. Celice smo inkubirali pri 37 C v minimalnem gojišču MEM, dopolnjenim z 10 % fetalnim govejim serumom, 1 % L-glutaminom in 1 % ne-esencialnih aminokislin v atmosferi, ki vsebuje 5 % CO 2. Po dveh dneh smo celice tretirali z malimi spojinami. Spojini 6G7 in 6C3 smo dodali v koncentracijah 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1 in 2 mm, medtem ko smo spojino 7C8 zaradi slabše topnosti testirali pri koncentracijah 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 in 100 µm. Spojine smo redčili do končne koncentracije v 3 % DMSO. Celice smo inkubirali preko noči, dodali reagent [3 (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolijev bromid (MTT) po protokolu (MTT cell viability reagent, Sigma-Aldrich), raztopili kristale v DMSO in merili absorbanco pri 570 nm z mikročitalcem Fluostar Galaxy. S spojinama 6C3 in 7C8 smo izvedli tri eksperimente, s spojino 6G7 pa štiri eksperimente Infiltracija proteinov NLP v liste tobaka Protein NLP Pp (400 nm, 100 µl, v MQ-vodi) ali NLP Pya (200 nm, 100 µl, v MQ-vodi) smo infiltrirali s plastično brizgo samega ali skupaj s spojinami 6G7, 6C3, 7C8 ali 6E11 v koncentracijah µm v spodnjo povrhnjico lista tobaka Nicotiana tabacum White Burley (starost 5-7 tednov). Površino razlitja raztopine proteina smo označili na površini lista. Po 24-ih urah smo preverili, v kolikšni meri je prišlo do nekroz. 34

49 5 REZULTATI 5.1 INTERAKCIJE PROTEINOV NLP Z LIPIDNIMI MEMBRANAMI Ekstrakcija celotnih lipidov iz listov tobaka Pripravili smo celotni lipidni ekstrakt iz listov rastlin tobaka (Nicotiana tabacum White Burley) v starosti 5-7 tednov. Prvotne ekstrakcije lipidov smo se lotili iz celotnega rastlinskega materiala, kar se je izkazalo za precej neučinkovito, saj smo poleg lipidov v vzorcih pridobili še precej pigmentov, ki so motili nekatere nadaljnje analize. Zato smo se v naslednjem koraku odločili, da pred ekstrakcijo lipidov odstranimo kloroplaste z uporabo protokola za izolacijo kloroplastov (Kubis s sod., 2008). S centrifugiranjem smo pripravili zvezni gradient Percolla (koloidni delci silicijevega dioksida, prevlečeni s polivinilpirolidonom), na katerega smo nato nanesli homogenizirane liste tobaka in gradient Percolla ultracentrifugirali po protokolu. Kloroplasti so bili skoncentrirani v zgornji frakciji (Slika 13), zato smo jih lahko odstranili. Preostali material smo previdno ločili na šest prostorninsko enakih frakcij (2 ml) in jih ekstrahirali v enakem volumnu mešanice kloroform : metanol = 2 : 1 preko noči. Spodnjo plast v epruveti z ekstrahiranimi lipidi smo prenesli v stekleno bučko in jo sušili na rotavaporju štiri ure. Lipidno plast smo prepihali z dušikom, zatesnili bučko s parafilmom in jo do uporabe shranili pri -20 C. Slika 13. Celotni ekstrakt lipidov iz tobaka. Homogenat tobakovih listov smo nanesli na gradient Percolla, odstranili zgornjo frakcijo in ločili preostanek na šest frakcij A-F (levo). Po 50 ng ekstrahiranih lipidov smo nanesli na ploščo TLC. Na ploščo smo nanesli tudi sfingolipide iz kvasovk BY in mutiranih kvasovk MYY. Ploščo smo razvili v kloroform : metanol : 4,2 M NH 4 OH = 9 : 7 : 2 in detektirali lipide z mešanico 10 % bakrovega sulfata in 8 % fosforne kisline. 35

50 5.1.2 Ekstrakcija sfingolipidov iz kvasovk Sfingolipidi kvasovk so dobro opisani, razmeroma enostavni in podobno grajeni kot enostavnejši GIPC pri dvokaličnicah. V membrani kvasovk so prisotni inozitol fosforilceramid IPC, manozilinozitol fosforilceramid MIPC in manozildiinozitol fosforilceramid M(IP) 2 C. Ekstrakcija v večjih količinah je enostavna, zato smo jih uporabili v nekaterih testih vzporedno z rastlinskimi lipidi, katerih priprava v večjih količinah je težavnejša. Za ekstrakcijo smo gojili divji tip kvasovk ter mutiran sev, ki nima prisotnih MIPC in M(IP) 2 C. Celično kulturo smo centrifugirali, da smo odstranili gojišče, oborili usedlino s triklorocetno kislino in ekstrahirali lipide v mešanici etanol : voda : dietileter : piridin : NH 4 OH = 15 : 15 : 5 : 1 : 0,018. Fosfolipide smo odstranili z alkalno metanolizo in frakcijo s sfingolipidi posušili in jih nato raztopili v kloroform : metanol : voda (16 : 16 : 5) ter po 50 ng lipidov nanesli na TLC ploščo (Slika 13, desno) Razvoj lipidnih ekstraktov s tankoplastno kromatografijo (TLC) Bučke z lipidnimi frakcijami iz tobakovih listov smo segreli na sobno temperaturo in vsaki dodali po 700 µl mešanice kloroform : metanol = 2 : 1 ter s tehtanjem določili koncentracijo lipidov v vsaki frakciji (Preglednica 6). Na ploščo za TLC smo nanesli po 50 ng lipidov šestih frakcij iz tobaka A-F ter po 50 ng sfingolipidov iz kvasovk BY in mutiranih kvasovk MYY. Po razvitju v komori za TLC smo lipide detektirali z mešanico bakrovega sulfata in fosforne kisline (Slika 13). Preglednica 6. Koncentracija ekstrahiranih lipidov iz homogenata tobakovih listov. Frakcija A B C D E F koncentracija 3,2 2,8 5,2 2,9 3,7 6,8 (mg/ml) Zastopanost lipidov je bila precej podobna v vseh šestih frakcijah, saj smo pri vseh opazili enakih šest lipidnih lis. Razlikovala se je le frakcija F, ki je imela dodatne lise v spodnji polovici plošče TLC. Sfingolipidi kvasovk so potovali v treh ločenih lisah, ki so bile na podobnem mestu kot dodatna lisa v frakciji F (Slika 13) Detekcija vezave proteina NLP Pp na celotne lipide iz tobaka in sfingolipide iz kvasovk Na ploščo TLC smo nanesli frakciji A in F iz celotnega lipidnega ekstrakta tobaka, fitosfingozin (FS), D-eritro-sfingozil fosfoinozitol (lizo-ipc) in sfingolipidna ekstrakta iz kvasovk BY in mutiranega seva kvasovk MYY. Po razvitju lipidov v komori za TLC smo ploščo dobro posušili v desikatorju in prenesli lipide iz plošče TLC na membrano PVDF, ki smo jo predhodno namakali 30 s v aktivacijski mešanici. Ob prenosu lipidov se prenese 36

51 približno polovica lipidov na membrano PVDF, preostanek pa smo detektirali z namakanjem v mešanici 10 % bakrovega sulfata in 8 % fosforne kisline. Ploščo TLC smo segrevali pri 110 C 5 min do pojava rjavih lipidnih lis (Slika 14). Lipidi so potovali podobno kot pri predhodno razviti plošči (Slika 13). Membrano PVDF smo inkubirali dve uri s proteinom NLP Pp, ki ga izloča Phytophthora parasitica, nato pa po eno uro s primarnimi protitelesi in sekundarnimi protitelesi, označenimi s hrenovo peroksidazo. Med posameznimi inkubacijami in pred detekcijo smo membrano spirali trikrat po 10 min s pufrom TBS. Opazili smo vezavo proteina NLP Pp na frakcijo F iz lipidnega ekstrakta iz listov tobaka ter na sfingolipide iz kvasovk BY. Do vezave proteina NLP Pp na FS, lizo- IPC, frakcijo F in sfingolipide mutiranih kvasovk MYY ni prišlo (Slika 14). Slika 14. Vezava proteina NLP Pp na frakcijo F in sfingolipide BY. Na ploščo TLC smo nanesli 100 ng fitosfingozina (FS), D-eritro-sfingozil fosfoinozitola (lizo- IPC), frakciji A in F iz tobakovega celotnega ekstrakta lipidov in sfingolipide iz kvasovk BY in MYY in lipide razvili v mešanici kloroform : metanol : 4,2 M NH 4 OH = 9 : 7 : 2. Lipide smo prenesli na membrano PVDF, inkubirali s proteinom NLP Pp in z ustreznimi protitelesi ter detektirali vezavo s kitom ECL. Ostanek lipidov na plošči TLC smo detektirali z mešanico 10 % bakrovega sulfata in 8 % fosforne kisline (levo). Protein NLP Pp se veže na frakcijo F in sfingolipide BY (desno). Protein NLP Pp se je vezal na lipid v frakciji F, ki je potoval po plošči TLC v obliki treh lis (Slika 13). Teh lipidov je bilo v frakciji zelo malo, zato smo jih želeli obogatiti in ločiti na tri posamezne podfrakcije, kot je opisano v poglavju Ločene frakcije smo označili z oznakami F-1, F-2 in F-3 ter jih skupaj z izvorno frakcijo F ter sfingolipidi kvasovk BY in MYY ponovno prenesli iz plošče TLC na membrano PVDF ter jo inkubirali z NLP Pp. Zopet smo potrdili vezavo na frakcijo F, pri ločitvi frakcije F na tri podfrakcije pa smo opazili, da se protein NLP Pp veže na srednjo lipidno liso, F-2. Ravno tako smo potrdili vezavo na obojne sfingolipidne vzorce iz kvasovk, BY in MYY (Slika 15). 37

52 Slika 15. Vezava proteina NLP Pp na frakcijo F, podfrakcijo F-2 in sfingolipide BY in MYY. Na plošči TLC smo razvili po 100 ng frakcije F, podfrakcij F-1, F-2, F-3 ter 100 ng sfingolipidov BY in MYY (v mešanici kloroform : metanol : 4,2 M NH 4 OH = 9 : 7 : 2), prenesli lipide na membrano PVDF in inkubirali s proteinom NLP Pp ter ustreznimi protitelesi. Ostanek lipidov na plošči TLC smo detektirali z mešanico 10 % bakrovega sulfata in 8 % fosforne kisline (levo). Vezavo proteina smo detektirali z uporabo kita ECL. Protein NLP Pp se veže na frakcijo F, podfrakcijo F-2 in sfingolipide BY ter MYY (desno) Odtis western Za analize smo imeli na voljo protitelesa, pripravljena po imunizaciji kuncev s proteinom NLP Pp, ki smo jih dobili od Isabell Albert (ZMBP). Pred uporabo teh protiteles v metodi detekcije vezave proteina NLP Pya, ki ga izloča Pythium aphanidermatum, na GIPC, smo testirali, če se omenjena protitelesa vežejo tudi na ta protein. Z uporabo odtisa western smo pokazali, da protitelesa, proizvedena proti NLP Pp prepoznavajo tudi NLP Pya (Slika 16), kar nakazuje tudi na zelo verjetno podobnost v terciarni zgradbi teh dveh proteinov. 38

53 Slika 16. Protitelesa, proizvedena proti NLP Pp se vežejo tudi na NLP Pya. Levo prikazujemo potovanje proteinov NLP Pp in NLP Pya na gelu NaDS, desno pa membrano PVDF po odtisu western. PL; proteinska lestvica, NaDS; gel za NaDS-PAGE, WB; membrana PVDF po izvedenem odtisu western Detekcija vezave proteina NLP Pya na GIPC iz tobaka Lipidov v rastlinskih celicah je malo, zato so bili tudi izkupički ekstrakcije kljub veliki začetni masi tobakovih listov borni. Po začetnih eksperimentih smo opazili, da se protein NLP Pp veže na sfingolipide BY in MYY iz kvasovk. Po pregledu literature smo ugotovili, da je polarna glava kvasnih sfingolipidov dokaj podobna seriji A GIPC, ki jih sicer najdemo pri dvokaličnicah. Tobakovi GIPC imajo pripeto na inozitol fosforilceramid glukuronsko kislino in še en monosaharid. Sfingolipidi kvasovk imajo poleg IPC še dva sfingolipida. Pri MIPC sta na IPC pripeti fosfatna skupina in manoza, pri M(IP) 2 C pa sta na osnovno MIPC dodani še ena fosfatna skupina in inozitol. Glede na to, da se protein NLP veže na sfingolipide kvasovk, so možna tarča v rastlinski celici strukturno podobni GIPC. Tako smo po novem protokolu (Cacas s sod., 2013) iz listov tobaka ekstrahirali GIPC. Lipide smo razvili na plošči TLC, skupaj s kontrolnimi lipidi DOPC, gangliozidi (gangl) in sfingomielinom (SM). Po razvitju smo ploščo TLC barvali najprej s primulinom, ki pobarva vse lipide (Slika 17) in nato še z orcinolom, ki specifično pobarva samo pentoze in heksoze, torej obarva GIPC. Glede na barvanje z orcinolom lahko sklepamo, da imamo v ekstraktu GIPC vsaj osem različnih sfingolipidov (Slika 17). 39

54 Slika 17. GIPC, ekstrahirani iz listov tobaka. Na ploščo TLC smo nanesli 100 ng naslednjih lipidov: DOPC, gangliozidi, GIPC iz listov tobaka in SM. Mobilna faza je bila mešanica kloroform : metanol : 2 M NH 4 OH = 65 : 25 : 4. Ploščo TLC smo po razvitju najprej barvali z 0,05 % primulinom in jih detektirali z UV-svetlobo (levo) in nato še z 2 % orcinolom. Detekcijo smo naredili s 5-minutnim segrevanjem na plošči pri 120 C (v sredini). Protein se je vezal na spodnjo liso GIPC (desno). Lipide iz plošče TLC smo prenesli na membrano PVDF po že opisanem postopku in jo inkubirali s proteinom NLP Pya ter z ustreznimi protitelesi za detekcijo proteina. Opazili smo, da se protein veže na spodnje lipidne lise iz celotne frakcije GIPC. Na plošči TLC smo opazili vezavo proteina na spodnjo liso GIPC. Vezave na kontrolne lipide DOPC, gangliozide in SM nismo opazili (Slika 17) Vezava proteina NLP Pya na SUV pripravljene iz sfingolipidov BY in MYY Iz sfingolipidov kvasovk divjega tipa smo pripravili SUV in jih vezali na površino senzorskega čipa L1. Ta ima na dekstranskem matriksu vezane acilne verige, na katere se ujamejo SUV in omogočajo študije interakcij proteinov z lipidnim dvoslojem. Vezavo proteina NLP Pya smo opazovali s pomočjo površinske plazmonske resonance. Čip L1 smo najprej ekvilibrirali na sobno temperaturo in ga sprali z nosilnim pufrom. Nanos veziklov na čipu je bil ponovljiv, saj smo pri prvi titraciji proteina nanesli 632,0 ± 36,7 RU veziklov, pri drugi titraciji pa 458,2 ± 13,7 RU. Prvo pretočno celico smo pustili prazno in je služila kot referenčna celica, na kateri smo nadzorovali morebitno nespecifično vezavo proteina na površino čipa. Titracijo proteina smo ponovili dvakrat, pri čemer smo pred vsakim nanosom proteina v koncentracijah 0, 312 nm, 625 nm, 1,25 µm, 2,5 µm in 5 µm vezikle sprali s 40 mm OG in nanesli sveže vezikle na drugo pretočno celico. Potrdili smo vezavo proteina NLP Pya v mikromolarnem območju, saj se NLP Pya veže že pri najnižji koncentraciji, ki smo jo testirali (312 nm). Asociacija in disociacija sta precej hitri. S pomočjo programa Biacore T100 Evaluation software in modelom dinamičnega ravnotežja (ang. Steady State Affinity model) določili K D vezave NLP Pya na sfingolipide BY, ki je znašal 2,1 ± 0,1 µm. Eksperiment smo izvedli dvakrat (Slika 18). 40

55 Odziv (RU) Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami nm 625 nm 1250 nm 2500 nm 5000 nm Čas (s) c (nm) Slika 18. Vezava NLP Pya na SUV, pripravljenih iz sfingolipidov kvasovk BY. NLP Pya s koncentracijami 0, 312 nm, 625 nm, 1,25 µm, 2,5 µm in 5 µm se veže na SUV (levo). Odziv pufra in vezave na prazno pretočno celico smo odšteli od vezave proteina na vezikle. Ravnotežne odzive pet sekund pred koncem asociacije smo prilegali modelu dinamičnega ravnotežja in določili K D 2,1 ± 0,1 µm (n=2) (desno). Preverili smo tudi vezavo proteina NLP Pya na SUV, pripravljene iz sfingolipidov, ekstrahiranih iz seva MYY89, ki ima okvarjen gen za sintezo MIPC in M(IP) 2 C. Eksperiment smo izvedli enako kot s SUV iz BY. Vezikle smo zopet vezali na površino očiščenega senzorskega čipa L1 za vsako koncentracijo proteina posebej z visoko ponovljivostjo nanosa (R imm = 981,2 ± 42,7 RU). Vbrizgali smo protein NLP Pya v koncentracijah 0, 312 nm, 625 nm, 1,25 µm in 2,5 µm. Tudi za to interakcijo smo izračunali K D, ki je bil primerljiv z interakcijo proteina NLP Pya s SUV iz sfingolipidov običajnega seva kvasovke. Afiniteta proteina NLP Pya do veziklov iz sfingolipidov, ekstrahiranih iz seva MYY89, znaša 1,1 µm (Slika 19). 41

56 Odziv (RU) Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami nm 625 nm 1250 nm 2500 nm Čas (s) c (nm) Slika 19. Vezava proteina NLP Pya na SUV, pripravljenih iz sfingolipidov MYY. NLP Pya s koncentracijami 0, 312 nm, 625 nm, 1,25 µm in 2,5 µm se veže na SUV (levo). Odziv pufra in vezave na prazno pretočno celico smo odšteli od vezave proteina na vezikle. Ravnotežne odzive pet sekund pred koncem asociacije smo prilegali modelu dinamičnega ravnotežja in določili K D 1,1 µm (desno) Vezava ekstraktov GIPC na protein NLP Pp Interakcijo med proteinom iz družine NLP in sfingolipidi smo s SPR preizkusili tudi v obratni orientaciji. Na senzorski čip CM5 smo preko aminskih skupin kovalentno vezali protein NLP Pp. Čip CM5 ima na zlato površino pripet karboksiliran dekstranski matriks. Po aktivaciji karboksilnih skupin z mešanico EDC in NHS se z aminsko skupino na proteinu tvori kovalentna vez, ki omogoča stabilno površino za študije raznih interakcij. Preko NLP Pp smo injicirali dva vzorca GIPC, ki smo jih pridobili od skupine prof. dr. Nürnberger (ZMBP, Nemčija). Prvi so bili ekstrahirani iz A. thaliana, drugi pa iz cvetače. Testirali smo tudi ekstrakte sfingolipidov kvasovk, ki smo jih pridobili z ekstrakcijo iz kvasovk po protokolu v poglavju Sfingolipide, raztopljene v različnih topilih (Preglednica 3), smo pred nanosom 100- oz. 200-x redčili v nosilnem pufru. Vzorce smo nanašali tri minute in še naslednje štiri minute spremljali disociacijo pri pretoku 10 µl/min. Lipide smo vsakič odstranili z dvema kratkima pulzoma 0,07 % SDS. GIPC iz A. thaliana in cvetače so se vezali. Vezava je bila odvisna od koncentracije, asociacija je bila precej počasna, disociacija pa zelo počasna, še posebej pri GIPC, ki so praktično ostali vezani skoraj v celoti na protein (Slika 20). Pri kontrolnih lipidih POPC in sfingomielinu do vezave ni prišlo. Natančnejša karakterizacija ni bila mogoča, saj smo imeli zelo omejeno količino vzorcev. 42

57 Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami x GIPC A. thaliana 200x GIPC A. thaliana 100x GIPC cvetača 200x GIPC cvetača 0,25 mg/ml SM 0,25 mg/ml POPC Čas (s) Slika 20. Vezava GIPC iz A. thaliana in cvetače na NLP Pp. Na čip smo kovalentno imobilizirali NLP Pp in preko njega spuščali različne lipidne vzorce. Vzorcom GIPC nismo mogi določiti koncentracije in smo jih pred nanosom 100-x ali 200-x redčili v nosilnem pufru. Čas asociacije in disociacije je bil 3 minute, pretok 10 µl/min. Kot kontroli smo preko proteina vbrizgali POPC in SM. Prikazujemo odzive vezave lipidov na protein, od katerih sta odšteti morebitna nespecifična vezava na prazno celico (Fc1) in prispevek ustrezno redčenega topila v nosilnem pufru. Na protein NLP Pp so se s podobno kinetiko kot GIPC iz A. thaliana in cvetače vezali tudi sfingolipidi iz kvasovk MYY, katerih vezavo smo testirali pri identičnih pogojih (Slika 21). Sfingolipidi iz divjega tipa kvasovk BY se niso vezali. Ker nismo mogli izračunati koncentracije sfingolipidov zaradi premajhne količine materiala, je možno, da do vezave ni prišlo, ker smo uporabili prenizko koncentracijo lipidov. Natančnejša karakterizacija ni bilo možna, saj smo imeli na voljo omejeno količino tudi teh vzorcev sfingolipidov kvasovk. 43

58 Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami x sfingolipidi MYY 200x sfingolipidi BY Čas (s) Slika 21. Vezava sfingolipidov iz kvasovk na NLP Pp. Na čip smo imobilizirali NLP Pp in preko njega injicirali v nosilnem pufru 200-x redčene sfingolipide BY in MYY. Čas asociacije in disociacije je bil 3 minute, pretok 10 µl/min. Prikazujemo odzive vezave lipidov na protein (Fc2), od katerih sta odšteti nespecifična vezava na Fc1 in prispevek 200-x redčenega topila v nosilnem pufru Interakcija fluorescenčno označenega proteina NLP Pya s protoplasti kvasovk Pokazali smo, da se protein NLP Pp veže na sfingolipide iz kvasovk, zato smo želeli preveriti, kako je z vezavo proteinov iz družine NLP na protoplaste kvasovk. Kvasovke imajo poleg lipidne membrane še celično steno, sestavljeno iz β-1,3 glukanov, glikoproteinov in β-mananov. Za odstranitev stene smo kvasovke inkubirali z litikazo, encimom, ki hidrolizira 1,3 glikozidno vez. Kvasni protoplasti so precej nestabilni, zato smo delali pri pogojih, ko je približno polovica kvasovk bila brez celične stene. Protein NLP Pya in HaNLP3 smo fluorescenčno označili z barvilom Alexa Fluor 488 NHS Ester. Aktivnost označenega proteina smo testirali pri dveh koncentracijah z infiltracijo v liste tobaka in potrdili, da označevanje ne vpliva na nekrotično aktivnost (Slika 22). 44

59 Slika 22. Aktivnost označenega proteina Alexa488-NLP Pya. V spodnjo povrhnjico lista tobaka smo infiltrirali po 100 µl NLP Pya s koncentracijama 0,4 µm in 0,8 µm (zgoraj) in po 100 µl Alexa488-NLP Pya s koncentracijama 0,4 µm in 0,8 µm (spodaj). Nekroze smo slikali po 24-ih urah. Aktivnost označenega proteina je enaka kot pri neoznačenemu NLP Pya. Označeni protein Alexa488-NLP Pya (100 µm, 10 µl) smo inkubirali z mešanico protoplasti : kvasovke = 1 : 1 (10 µl). Mešanico smo dvakrat sprali in s konfokalnim mikroskopom preverili, če se protoplasti obarvajo zeleno. Opazili smo, da je bila približno polovica celic obarvanih zeleno, iz česar sklepamo, da se je Alexa488-NLP Pya vezal na protoplaste (Slika 23). Slika 23. Vezava proteina Alexa488-NLP Pya na protoplaste kvasovk. 10 µl vzorca protoplastov smo inkubirali z 10 µl 100 µm Alexa488-NLP Pya. Po spiranju smo vzorce pregledali s konfokalnim mikroskopom v svetlem polju (levo) in v območju med 532 in 561 nm (desno). V sredini prikazujemo oba pogleda združena. Približno polovica celic je bila obarvanih zeleno. Vzorec, v katerem so bile prisotne samo intaktne kvasovke z ohranjeno celično steno, smo 45

60 pripravili z enakim protokolom. Po pričakovanjih nismo opazili vezave na kvasovke, saj je kvasovke obdajala celična stena in onemogočala interakcijo proteina NLP Pya s plazmalemo (Slika 24). Slika 24. Vezava proteina Alexa488-NLP Pya na kvasovke. 10 µl kvasovk smo inkubirali skupaj z 10 µl 100 µm Alexa488-NLP Pya. Po spiranju smo vzorce pregledali s konfokalnim mikroskopom v svetlem polju (levo) in v območju med 532 in 561 nm (desno). V sredini prikazujemo oba pogleda združena. Celice niso bile označene s proteinom. Znano je, da so v družini proteinov NLP tudi predstavniki, ki ne delujejo nekrotično na dvokaličnice. Zanimalo nas je, če se netoksični predstavnik iz družine NLP, HaNLP3 tudi veže na protoplaste, zato smo ga predinkubirali skupaj s protoplasti in preverili vezavo s konfokalnim mikroskopom. V nasprotju z Alexa488-NLP Pya pa se netoksični protein na protoplaste ni vezal (Slika 25). Slika 25. Netoksični Alexa488-HaNLP3 se na protoplaste ne veže. 10 µl vzorca protoplastov smo inkubirali skupaj z 10 µl 100 µm Alexa488-HaNLP3. Po spiranju smo vzorce pregledali s konfokalnim mikroskopom v svetlem polju (levo) in v območju med 532 in 561 nm (desno). V sredini prikazujemo oba pogleda združena. Vezave netoksičnega predstavnika iz družine NLP nismo zaznali. Vse vzorce smo pripravili enako tudi za eksperimente s pretočnim citometrom. Spremljali smo faktor FL1, ki ponazori, kolikšen del opazovane populacije celic je označen s 46

61 fluorescenčno označenim proteinom. Opazili smo, da je do premika spektra prišlo le v primeru predinkubirane mešanice proteina Alexa488-NLP Pya in protoplastov, ne pa, ko je bil s protoplasti inkubiran Alexa488-HaNLP3 (Slika 26). Slika 26. Vezava proteinov Alexa488-NLP Pya in Alexa488-HaNLP3 na protoplaste in kvasovke. 10 µl protoplastov (modro) oz. kvasovk (rdeče) smo inkubirali skupaj z 10 µl 100 µm Alexa488- NLP Pya (levo) oz. z 10 µl 100 µm Alexa488-HaNLP3 (desno). Do vezave na protoplaste je prišlo le v primeru, ko smo predinkubirali Alexa488-NLP Pya s protoplasti Vezava inozitol fosfatov na NLP Znano je, da je prvi gradnik, ki je dodan na osnovni ceramidni del pri nastanku GIPC, inozitolni obroč. Inozitol je prisoten tudi v zgradbi sfingolipidov kvasovk. Testirali smo, ali se fosforilirana inozitola vežeta na protein NLP Pp, kar bi nakazalo, da sta udeležena v interakciji proteinov NLP z lipidi v membrani gostiteljske celice. Preko imobiliziranega proteina NLP Pp smo injicirali inozitol-1,3-p in inozitol-1,5-p v koncentracijah 0, 31,25 µm, 62,5 µm, 125 µm, 250 µm, 0,5 mm, 1 mm in 2 mm. Kot nosilni pufer smo uporabili 20 mm HEPES, 150 mm NaCl, ph 7,7. Regenerirali smo s 30-sekundnim pulzom 1 M NaCl. Podatke smo prilegali modelu dinamičnega ravnotežja. K D za inozitol-1,3-p je 0,38 mm in za inozitol-1,5-p 1,25 mm (Slika 27). 47

62 Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami. A 120 B C Čas (s) D 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 120 Koncentracija (mm) Čas (s) 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Koncentracija (mm) Slika 27. Vezava inozitol-1,3-p in inozitol-1,5-p na protein NLP Pp. Testirali smo vezavo inozitol-1,3-p (A) in inozitol-1,5-p (C) na protein NLP Pp. Injicirane koncentracije inozitolov so bile: 31,25 µm (črno), 62,5 µm (rdeče), 125 µm (zeleno), 250 µm (modro), 500 µm (vijolično), 1 mm (sivo) in 2 mm (oranžno). Odzive pet sekund pred koncem asociacije smo prilegali modelu dinamičnega ravnotežja in izračunali afiniteto vezave. K D za inozitol-1,3-p je 0,38 mm (B) in za inozitol-1,5-p 1,25 mm (D). Prikazujemo odzive vezave na protein, od katerih je bil odštet prispevek nosilnega pufra in nespecifična vezava na Fc Vezava sladkorjev na protein NLP Znano je, da so osnovni gradniki GIPC različne heksoze, zato smo na senzorski čip CM7, ki omogoča najvišje nivoje imobilizacije, imobilizirali protein NLP Pya in testirali vezavo 26-ih različnih sladkorjev (Preglednica 7), morebitnih gradnikov GIPC pri koncentracijah 0, 0,1 in 1 mm. 48

63 Preglednica 7. Seznam testiranih sladkorjev z metodo SPR. Oznaka sladkorja Ime sladkorja Vezava pri 1 mm S1 glukuronska kislina + S2 galaktoza - S3 N-acetilglukozamin - S4 α-d-glukozamin hidroklorid + S5 manoza - S6 α-d-metilglikozid - S7 manozamin + S8 manoza (drug vir) - S9 glukoza - S10 N-acetil neuraminska kislina - S11 N-acetilgalaktozamin - S12 maltoza - S13 saharoza - S14 fruktoza - S15 laktoza - S16 rafinoza - S17 riboza - S18 fukoza - S19 trehaloza - S20 ramnoza - S21 ksiloza - S22 sorbitol - S23 manitol - S24 dulcitol - S25 arabinoza - S26 celobioza - S27 melibioza - Ugotovili smo, da se na NLPPp vežejo glukuronska kislina, glukozamin in manozamin. Zanimivo je, da ne pride do vezave z glukozo in manozo (Preglednica 7). Pri večini sladkorjev do vezave ni prišlo pri testiranih koncentracijah, kot prikazano na sliki (Slika 28). 49

64 Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami Čas (s) Slika 28. Vezava sladkorjev na protein NLP Pya. Glukuronska kislina (oranžno), manozamin (sivo) in glukozamin (vijolično) v koncentraciji 1 mm se vežejo na NLP Pya, medtem ko se ostali sladkorji ne vežejo. Od teh prikazujemo samo odziv z manozo (zeleno) in glukozo (modro), z ostalimi smo dobili zelo podobne senzorgrame. Prikazujemo odzive vezave na protein, od katerih sta odšteti nespecifična vezava in prispevek nosilnega pufra. Glukuronska kislina, glukozamin hidroklorid in manozamin smo nadalje testirali v titracijskem eksperimentu. Sladkorje smo vbrizgali v koncentracijah 0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 in 1 mm za 60 sekund. Regeneracija ni bila potrebna. Odzive pet sekund pred koncem asociacije smo prilegali modelu vezave dinamičnega ravnotežja s programom Biacore T100 Evaluation Software. Afinitete nismo mogli določiti, saj je vezava bila zelo šibka, v milimolarnem območju. Vsekakor pa smo pokazali zelo očitno razliko v vezavi med glukuronsko kislino, glukozaminom in manozaminom, ki se vežejo in ostalimi, s katerimi vezave ni bilo (Slika 29). 50

65 Slika 29. Titracija sladkorjev, ki se vežejo na protein NLP Pya. Levo so prikazani odzivi vbrizganja glukuronske kisline (A), manozamina (C) in glukozamina (E) preko proteina NLP Pya. Injicirali smo koncentracije 0,05 (črno), 0,1 (rdeče), 0,2 (zeleno), 0,4 (modro), 0,6 (vijolično), 0,8 (sivo) in 1 mm (oranžno). Podatke smo prilegali modelu dinamičnega ravnotežja (desni stolpec). Prikazujemo odzive vezave na protein, od katerih sta odšteti nespecifična vezava in prispevek nosilnega pufra Vezava glikozidov Po začetnih analizah z monosaharidi smo videli, da pride do vezave tudi z manozaminom in glukozaminom, ne pa z manozo in glukozo, zato smo predvidevali, da je za vezavo potrebna modificirana heksoza. V sodelovanju s prof. Markom Anderluhom (Fakulteta za farmacijo) smo pripravili spremenjene manoze, kot je razvidno v preglednici (Preglednica 4). Na čip CM5 smo imobilizirali protein NLP Pp (R imm = RU). Čip smo sprali z nosilnim pufrom (20 mm MES, 150 mm NaCl, 3,3 % DMSO, ph 5,8) in titrirali glikozide pri koncentracijah 0, 1, 1,25, 2, 2,5, 4, 5, 8 in 10 mm. Spojino AAA-11 smo zaradi slabše topnosti titrirali pri koncentracijah 0, 0,125, 0,25, 0,5, 1 in 2 mm. Vsi glikozidi so se sicer 51

66 Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami. vezali, a je odziv s koncentracijo linearno naraščal, kar kaže na zelo šibko vezavo (Slika 30). A B C Čas (s) D Čas (s) E Čas (s) F Čas (s) Čas (s) Čas (s) Slika 30. Titracija glikozidov preko proteina NLP Pp. Detektirali smo vezavo 1, 1,25, 2, 2,5, 4, 5, 8 in 10 mm AAA-10 (A), AAA-12 (C), AAA-13 (D), AAA-9e (E) in ANH6 (F) ter 0,125, 0,25, 0,5, 1 in 2 mm AAA-11 (B). Prispevek pufra in nespecifične vezave na prazno celico je odštet. Strukture spojin so navedene v preglednici (Preglednica 4) Infiltracije mutantov Tea Lenarčič (Kemijski inštitut) je pripravila nekaj mutantov NLP Pya, pri katerih je aspartat na mestu 158 zamenjala z alaninom, fenilalaninom, levcinom, glutamatom in lizinom. Pokazala je namreč, da je aspartat na tem mestu pomemben za koordinacijo Mg 2+ in sladkorja. Pripravila je tudi mutant, ki je imel triptofan na mestu 155 zamenjan z alaninom. Protein NLP Pya in mutante smo pripravili v koncentraciji 0,2 µm in jih infiltrirali v spodnjo povrhnjico lista tobaka in po 48-ih urah opazovali nastanek nekroz. Opazili smo, da menjava aspartata z alaninom pri mutantu D158A ni bistveno zmanjšala obseg nekroze, medtem ko so mutacije aspartata v hidrofobni fenilalanin in levcin ali večji, nabiti glutamat in lizin pomenile bistveno zmanjšanje nekroz. Pri mutantu W155A nismo opazili nekroz (Slika 31). 52

67 Slika 31. Infiltracija proteina NLP Pya in mutantov v liste tobaka. Proteine smo infiltrirali v spodnjo povrhnjico lista tobaka in obseg nekroz fotografirali po 48-ih urah. 5.2 ZAVIRANJE NEKROTIČNE AKTIVNOSTI PROTEINOV NLP Test vezave spojin na NLP Pya iz baze spojin Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani Analizirali smo vezavo spojin, ki jih imajo v knjižnici spojin na Fakulteti za farmacijo. V knjižnici imajo zbrane spojine, ki so komercialno večinoma nedostopne. Izbrali smo 587 spojin, ki ustrezajo Pravilu Lipinskega in so tako primerne za razvoj in uporabo fitofarmacevtskih učinkovin (Lipinski, 2016). Približno tretjina spojin je imela molsko maso pod 300 Da in so tako ustrezale fragmentom. Fragmenti so male molekule, imajo običajno slabšo afiniteto do določenega proteina, a predstavljajo dobro izhodišče za načrtovanje spojin z boljšo afiniteto. Spojine smo pripravili kot založne raztopine v 100 % DMSO in jih nato ustrezno redčili, da je bila končna koncentracija DMSO 5 %. Vezavo na imobiliziran NLP Pya smo testirali pri koncentracijah 0, 20 in 200 µm v nosilnem pufru s 5 % DMSO (20 mm MES, 150 mm NaCl, 5 % DMSO, ph 5,8). Tipične odzive po začetnem presejalnem testu prikazuje spodnja slika (Slika 32). V primeru, da se je analit vezal, smo določili točko vezave, to je odziv pet sekund pred koncem asociacije. Točke vezave smo primerjali med obema koncentracijama vsakega analita (Slika 32D). Odziv ob vezavi je naraščal s koncentracijo pri 67-ih spojinah (Slika 32A), večina spojin pa se po pričakovanjih ni vezala (Slika 32B). Nekaj spojin ni bilo topnih pri uporabljenih pogojih (Slika 32C) in smo jih izločili iz nadaljnjih študij. 53

68 Slika 32. Primeri vezave spojin iz zbirke spojin Fakultete za farmacijo na NLP Pya. Spojine smo testirali v koncentracijah 0 (črno), 20 (rdeče) in 200 µm (modro). Nekatere spojine so se vezale koncentracijsko odvisno (A), večina spojin pa se ni vezala (B). Nekaj spojin pri uporabljenih pogojih ni bilo topnih (C). Z vsake krivulje smo odčitali odziv, ki smo ga izmerili pet sekund pred koncem asociacije (D). Spojine, ki so izkazale koncentracijsko odvisen odziv, smo uporabili v nadaljnjih titracijah. Senzorgrami ob vezavi so bili takšni, kot so značilni za male spojine, s hitro asociacijo in hitro disociacijo. Spojine, ki se niso vezale in niso bili popolnoma topne v nosilnem pufru, smo izločili iz nadaljnjih raziskav. Titracije smo nadaljevali s 67 spojinami, ki so po prvem testu izkazale odziv, odvisen od koncentracije. Spojine smo injicirali v koncentracijah, prilagojenih topnosti spojin v nosilnem pufru. Krivuljam vezave smo določili nivo vezave 5 s pred koncem asociacije in te točke primerjali za različne koncentracije. Odzive vezave na protein NLP Pya, imobiliziran na čipu CM5, smo prilegali modelu vezave dinamičnega ravnotežja. Po opravljenih titracijah 67 spojin smo izbrali šest spojin, ki so se najbolje vezale (Slika 33). 54

69 Odziv (kru) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv(RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami. A C Čas (s) Čas (s) 12,5 µm 5B7 25 µm 5B7 50 µm 5B7 100 µm 5B7 200 µm 5B7 B D 7.8 µm 5D µm 5D µm 5D µm 5D6 125 µm 5D Koncentracija (µm) Koncentracija (µm) E G I K Čas(s) µm 5D µm 5D µm 5D µm 5D µm 5D Čas (s) µm 6G µm 6G µm 6G7 25 µm 6G7 50 µm 6G7 100 µm 6G7 200 µm 6G Čas (s) Čas (s) 1,562 µm 7C8 3,125 µm 7C8 6,25 µm 7C8 12,5 µm 7C8 25 µm 7C8 50 µm 7C8 100 µm 7C µm 6C µm 6C µm 6C µm 6C µm 6C µm 6C3 625 µm 6C3 F H J L Koncentracija (µm) Koncentracija (µm) Koncentracija (µm) Čas (s) 12,5 µm 6E11 25 µm 6E11 50 µm 6E µm 6E µm 6E11 Slika 33. Titracija šestih najbolj obetavnih spojin na NLP Pya. 55

70 Najobetavnejše spojine po titracijah spojin so bile 5B7 (A), 5D6 (C), 5D11 (E), 6G7 (G), 7C8 (I) in 6C3 (K). Spojinam 5B7, 5D6 in 5D11 (B, D, F) nismo mogli določiti afinitete, ker je bila ta previsoka in zunaj ranga titracij. Afiniteta spojine 6G7 je bila določena 130,9 ± 36,4 µm (n=6) (H) in spojine 7C8 52,8 ± 6,0 µm (n=3) (J). Iz visokega odziva ob vezavi spojine 6C3 lahko sklepamo, da gre za promiskuitetno spojino (K). Spojina 6E11 se na protein ne veže (L). Spojine, ki so se vezale, so bile 5B7, 5D6, 5D11, 6G7, 7C8 in 6C3 (Slika 33A, C, E, G, I in K). Spojine 5B7, 5D6 in 5D11 so se sicer vezale v uporabljenih koncentracijah, vendar je odziv linearno naraščal s koncentracijo, iz česar sklepamo, da je afiniteta teh spojin do proteina NLP Pya zelo šibka (Slika 33B, D, F). Afiniteto vezave na protein NLP Pya smo določili za dve spojini, 6G7 in 7C8 (Slika 33H, J). Afiniteta spojine 6G7 je 130,9 ± 36,4 µm (n=6) in spojine 7C8 52,8 ± 6,0 µm (n=3). Senzorgrami vezave spojine 6C3 so bili precej netipični za male spojine. Asociacija je bila počasna, spojina ni disociirala s proteina (Slika 33K). Odziv je znašal preko RU, kar je neobičajno visoko. Pri meritvah s SPR je odziv analita (male spojine) odvisen od njegove molekulske mase, molekulske mase liganda (proteina, imobiliziranega na površini čipa), imobilizacijske ravni liganda in stehiometrijskega razmerja med molekulama. Tako lahko za vsako interakcijo izračunamo, kakšen je pričakovan maksimalni odziv analita (Enačba 1). R max = MW (analit) / MW (ligand) * R imm * S Enačba 1 Kjer je: R max maksimalni odziv analita; MW (analit) molekulska masa analita; MW (ligand) molekulska masa liganda; R imm nivo imobilizacije liganda; S stehiometrijsko razmerje med analitom in ligandom. Pričakovan maksimalni odziv za spojino 6C3 je glede na enačbo 1 približno 120 RU, dejanski odziv ob vezavi pa je bil približno 100-x večji, kar je značilno za promiskuitetne spojine, ki se na določeno molekulo običajno vežejo nespecifično na različnih mestih (Slika 33K). Spojina 6E11 se na protein ne veže in je bila v nadaljnjih testih uporabljena kot negativna kontrola (Slika 33L). Strukture in imena vseh spojin na sliki 33 so navedena v preglednici (Preglednica 8). Strukture so vzete iz strani Strukturo komercialno nedostopne spojine 7C8 je določil in posredoval Izidor Sosič (Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani, Slovenija). 56

71 Preglednica 8. Strukture šestih najbolj obetavnih spojin in kontrolne spojine po testiranju s SPR. Oznaka Ime MW (Da) Struktura 5B7 4-fluoro-N-[2- (1-pirolidinil) etil] benzamid 272,7 5D6 1-metil-4-[2-(2-metilfenoksi) acetoksi] piperidinij 299,8 5D11 [(4S, 5R) -9-benzil-2-kloro-4,5- dihydropurin-6-il] amin 261,7 6G7 2-((4-metoksifenil) amino) benzojska kislina 243,3 7C8 2-(2-(1H-indol-3- il)acetamido)fenetil 2-(1H-indol-3- il)acetat 451,5 6C3 (2S, 4R) -2- (6-metil-4-okso-4Hkroman-3-il) -1,3-tiazolidin-4- karboksilna kislina 291,3 6E11 2-metil-5- (1,2,3,4- tetrahidroksilbutil) -3-furojske kisline 246,2 57

72 Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Odziv (RU) Hodnik V. Interakcije proteinov NLP z lipidnimi membranami. Vezavo spojin 6C3, 6G7 in 7C8 smo testirali tudi na protein NLP Pp. Pri spojini 6C3 se je spet pokazala nespecifična vezava, medtem ko sta K D za 6G7 in 7C8 bila podobna, kot smo določili pri NLP Pya, 71,9 ± 19,1 µm (n = 2) in 40,5 ± 29,7 µm (n =4) (Preglednica 9, Slika 34). A C E Čas (s) Čas (s) Čas (s) 25 µm 50 µm 100 µm 200 µm 400 µm 800 µm 12.5 µm 25 µm 50 µm 100 µm 5 µm 10 µm 20 µm 40 µm 80 µm 160 µm B D Koncentracija ( M) Koncentracija ( M) Slika 34. Vezava spojin 6G7, 7C8 in 6C3 na NLP Pp. Spojine 6G7, 7C8 in 6C3 se vežejo tudi na protein NLP Pp (A, C, E). Afiniteta spojine 6G7 na NLP Pp je bila 71,9 ± 19,1 µm (n=2) (B) in spojine 7C8 40,5 ± 29,7 µm (n=4) (D). Spojina 6C3 se tudi na protein NLP Pp veže promiskuitetno (E). Preglednica 9. Primerjava vrednosti K D za spojini 6G7 in 7C8. Spojina NLP Pya NLP Pp 6G7 130,9 ± 36,4 µm 71,9 ± 19,1 µm 7C8 52,8 ± 6,0 µm 40,5 ± 29,7 µm Infiltracija proteinov iz družine NLP s spojinami v liste tobaka Proteini NLP tvorijo nekrotične lezije ob infiltraciji v liste dvokaličnic. Spodnjo povrhnjico lista smo prebodli z iglo in nato s topo brizgo v list vbrizgali 100 µl raztopine proteina, ki 58

73 smo ga pred tem do ustrezne koncentracije redčili v MQ-vodi. Nastanek lezij je odvisen od koncentracije proteina in časa, ki mine po infiltraciji. Tipično z nekaj 100 nmkoncentracijami proteinov NLP pride do nekroz v 24-ih urah. List postane na predelu, kamor infiltriramo protein, tanjši, prozoren in sčasoma začne propadati (Slika 35). Slika 35. Infiltracija NLP Pya v liste tobaka povzroči nekrotične lezije. V spodnjo povrhnjico listov smo infiltrirali po 100 µl proteina NLP Pya v koncentracijah 15,6, 31,2, 62,5, 125, 250 in 500 nm in po 24-ih urah poslikali efekt na listih. Protein je bil po 24-ih nekrotičen v koncentraciji enaki in višji od 62,5 nm. Ko smo protein infiltrirali skupaj z malo spojino, smo pričakovali, da bodo nekroze z učinkovito spojino manjše ali bodo popolnoma izginile. Spojina ali ni imela učinka (nekroza ni bila zmanjšana), spojina je bila delno učinkovita (nekroze se bile delno zmanjšane) ali pa je spojina popolnoma zavrla delovanje proteina (nekroz ni bilo videti) (Slika 36). Slika 36. Učinki spojin na delovanje proteinov NLP. Spojine smo infiltrirali skupaj s proteinom in po 24-ih urah opazovali obseg nekroz na listih. Nekatere spojine niso delovale (levo), pri nekaterih smo opazili delno zaviranje nekrotične aktivnosti (v sredini), nekatere spojine pa so popolnoma zavrle nekroze ob infiltraciji (desno). Spojine 6G7, 7C8 in 6C3, ki so izkazale vezavo na proteina NLP Pp in NLP Pya v testih s SPR, smo testirali, če delujejo zaviralno na protein, v primeru, da spojino skupaj s proteinom NLP Pp vbrizgamo v spodnjo povrhnjico lista tobaka. Spodnjo povrhnjico lista smo poškodovali z iglo in vanjo infiltrirali z brizgo po 100 µl 400 nm proteina NLP Pp ali 59

74 400 nm proteina NLP Pp skupaj s spojino v koncentracijah od 125 µm do 1 mm. Za kontrolo smo pri enakih pogojih vbrizgali tudi spojino 6E11, ki se v predhodnih testih ni vezala na protein ter tudi samo MQ-vodo in 5 % DMSO, kar je bila končna koncentracija DMSO v mešanicah s spojinami (Slika 37). Slika 37. Vpliv inhibitorjev na nekrotično aktivnost proteina NLP Pp. V spodnjo povrhnjico lista smo vbrizgali 400 nm NLP Pp ali 400 nm NLP Pp skupaj s spojinami 6G7, 6C3, 7C8 ali 6E11 (v koncentracijah 125, 250, 500 in 1000 µm). Kot kontrolo smo vbrizgali tudi MQ-vodo in 5 % DMSO. Po 24-ih urah je prišlo do opaznih nekroz v listih tobaka, če smo infiltrirali 400 nm NLP Pp. Ob dodatku 125 µm 6C3 in 7C8 se je nekrotična aktivnost proteina močno zmanjšala, spojina 6G7 pa je učinkovala šele pri 500 µm. Spojina 6E11 ni zavirala nekrotične aktivnosti proteina NLP Pp pri nobeni od testiranih koncentracij (Slika 37). Testirali smo tudi učinek nekaterih spojin na NLP Pya. Uporabili smo 200 nm koncentracijo proteina in 1 mm koncentracijo spojin 6C3 in 6G7 ter 0,2 mm koncentracijo spojine 7C8. Vse tri spojine so zmanjšale nekroze (Slika 38). 60

75 Slika 38. Vpliv inhibitorjev na nekrotično aktivnost proteina NLP Pya. Infiltrirali smo 200 nm NLP Pya (A) skupaj z 1 mm 6C3 (B), 1 mm 6G7 (C) in 0,2 mm 7C8 (D). Efekte na listih smo fotografirali po 24-ih urah. Spojine so v vseh primerih zmanjšale nekrotične lezije na listu Toksičnost spojin za celice Caco-2 Spojine so primerne kot inhibitorji le, če niso toksične za okolico. Tako smo v sodelovanju z Majo Marušić in Simonom Casermanom (Kemijski inštitut) testirali toksičnost spojin na celicah Caco-2, celični liniji človeškega epitelnega adenokarcinoma debelega črevesa. Viabilne celice z aktivnimi oksidoreduktazami, odvisnimi od NAD(P)H, spremenijo reagent MTT v vijolično obarvan netopen produkt, formazan. Spojini 6G7 in 6C3 smo celicam Caco-2 dodali v koncentracijah 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1 in 2 mm, medtem ko smo spojino 7C8 zaradi slabše topnosti testirali pri koncentracijah 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 in 100 µm. Po inkubaciji preko noči smo dodali MTT. Produkte smo raztopili v DMSO in pomerili absorbanco pri 570 nm. Ugotovili smo, da spojina 7C8 zmanjša viabilnost celic Caco-2 za 35 % že pri 3,125 µm koncentraciji, pri 12,5 µm koncentraciji pa je bila preživelost celic Caco-2 le še 20 % v primerjavi s kontrolo, kjer celic nismo tretirali s kakšno od spojin. Spojina 6C3 do koncentracije 0,5 mm ni vplivala na preživelost celic, medtem ko se je pri koncentraciji 1 mm zmanjšal delež živih celic za 8 %, pri 2 mm pa za 15 %. Spojina 6G7 ni vplivala na živost celic Caco-2 niti pri najvišji testirani koncentraciji, ki je znašala 2 mm (Slika 39). To je koncentracija, ki je približno 10-x višja od koncentracije, ki je bila določena kot afiniteta te spojine do proteinov NLP. Tako prva testiranja kažejo, da je spojina primerna za uporabo v naravnem okolju. Slika 39. Test toksičnosti spojin 6G7, 6C3 in 7C8 na celicah Caco-2. Celicam Caco-2 smo dodali spojine 6G7, 6C3 in 7C8. Dodali smo reagent MTT in merili nastanek obarvanega produkta na spektrofotometru. Spojini 6G7 in 6C3 smo dodali v koncentracijah 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1 in 2 mm, spojino 7C8 pa smo testirali pri koncentracijah 3,125, 6,25, 12,5, 25, 61