Hrvatski B

Transcription

1 NaCI, Enzyme Test and Cold Agglutinins ID-Card Otkrivanje protutijela reaktivnih u fiziološkoj otopini i enzimu (za određivanje ABO protutijela, pretraživanje i identifikaciju protutijela, testove podudarnosti) Identifikacija proizvoda: 5050 UVOD Tehnike u fiziološkoj otopini koriste se u otkrivanju protutijela koja pretežno reagiraju na 4 C ili na 18 5 C (sobna temperatura), kao anti-m, -N, -P 1, -Le a, -Le b, -I. One se također koriste u definiranju hemolitičke anemije povezane s hladnim protutijelima (1). Enzimatske tehnike korisne su kad se želi povećana osjetljivost pri pretraživanju protutijela. One pojačavaju reakcije pojedinih protutijela, posebice u Rh, Kell i Kidd sustavu. Kako proteolitički enzimi obično razaraju neke antigene, kao M (MNS1), N (MNS), S (MNS3), Fya (FY1), Fyb (FY), enzimatska tehnika nikad ne smije biti upotrijebljena kao jedina. Ne smatra se neophodnim u redovite procedure pretraživanja protutijela uključiti test u fiziološkoj otopini na sobnoj temperaturi, no test u fiziološkoj otopini na 4 C može se koristiti u detekciji hladnih aglutinina (). ID-kartica NaCl, enzyme test and cold agglutinins pogodna je za pretraživanje i identifikaciju protutijela, testove podudarnosti i određivanje ABO protutijela.

2 REAGENSI ID-kartica NaCl, Enzyme Test and Cold Agglutinins sa 6 mikrostupaca koji sadrže neutralnu gel suspenziju. Prezervativ: < 0,1% NaN 3. Ne pohraniti kraj izvora topline, sustava za klimatiziranje i izlaza ventilacije. Stabilnost: vidi rok trajanja na naljepnici. DODATNI POTREBNI REAGENSI ID-Diluent 1: modificirana otopina bromelina za suspenzije eritrocita. ID-Diluent : modificirani LISS za suspenzije eritrocita. ID-Papain: otopina papaina za enzimatski test. ID-DiaCell I-II-III: za antiglobulinski test i hladne aglutinine. ID-DiaCell I-II-III P (papainizirani): za enzimatsku tehniku. ID-DiaCell I-II: za AHG test i hladne aglutinine. ID-DiaPanel: za AHG test i hladne aglutinine. ID- DiaPanel P (papainizirani): za enzimatsku tehniku. ID-DiaCell ABO: za određivanje ABO protutijela. ID-I negative cells (ID-I negativne stanice). (vidi upute u odgovarajućim pakiranjima) OSTALI POTREBNI MATERIJALI ID rastakalica ID pipetor ID nastavci za pipetor (ID-Tips) ID radni stol epruvete za suspenzije ID inkubator na 37 C ID centrifuga 6, 1 ili 4 Hladnjak ( 8 C)

3 3 1 UZORAK Za optimalne rezultate, za testiranje koristiti svježe uzeti uzorak ili u skladu s lokalnim laboratorijskim propisima o kriterijima prihvaćanja uzoraka. Poželjno je uzorak uzeti u citrat, EDTA ili CPD-A antikoagulans. Uzorci uzeti u obične epruvete (bez antikoagulansa) također se mogu koristiti. PRIPREMA KRVNOG UZORKA a) Eritrociti za test podudarnosti i autokontrolu u fiziološkoj otopini i enzimatskim tehnikama Pripremite 0,8% suspenziju eritrocita u ID-Diluentu, kako slijedi: Dozvolite da diluent dosegne sobnu temperaturu prije uporabe. 1. Ukapajte 1,0 ml ID-Diluenta u čistu epruvetu.. Dodajte 10 μl sedimenta eritrocita i lagano promiješajte. Ukoliko koristite punu krv direktno iz segmenta uz vrećicu krvi, 0 μl krvi dodajte u 1,0 ml ID-Diluenta. Suspenzija eritrocita može se odmah upotrijebiti. 4 μ a b) Plazma ili serum Kad se uzorci ne testiraju odmah, moraju se nakon odvajanja pohraniti na 8 C (vidi također pod Uzorak ), najviše 48 sati, a nakon toga na -0 C ili u skladu s lokalnim/nacionalnim zakonima/smjernicama. POSTUPAK TESTIRANJA Ne koristite ID-kartice koje pokazuju znakove sušenja, imaju mjehuriće ili oštećene pokrove, kapljice gela ili supernatanta u gornjem dijelu mikrostupaca ili na donjoj strani aluminijskog pokrova. Dozvolite staničnim reagensima, ID-diluentima, ID-Papainu te plazmi ili serumu da prije uporabe dosegnu sobnu temperaturu (osim za hladne aglutinine).

4 4 A) Pretraživanje protutijela I. Enzimatski test s papainiziranim stanicama ( ID-DiaCell I-II-III P ) Prije uporabe lagano resuspendirajte test stanice. 1. Označite odgovarajuće mikrostupce ID-kartice jedinstvenim brojem ili drugom oznakom pacijenta ili davatelja, kako je prikladno.. Uklonite aluminijski pokrov s onoliko mikrostupaca koliko trebate držeći karticu u uspravnom položaju. 3. Ukapajte 50 μl svake suspenzije test eritrocita Diacell I-II-III P (papainiziranih) u odgovarajuće mikrostupce (označene 1 3) 4. Ako se radi autokontrola, ukapajte 50 μl suspenzije eritrocita bolesnika u odgovarajući mikrostupac. 5. Dodajte po 5 μl plazme ili seruma od pacijenata ili davatelja u svaki mikrostupac. 6. Za autokontrolu dodajte 5 μl ID-Papaina u odgovarajući mikrostupac. 7. Inkubirajte ID-karticu 15 minuta na 37 C u ID-inkubatoru. 8. Centrifugirajte ID-karticu 10 minuta u ID-centrifugi. 9. Očitajte i zabilježite rezultate. II. Test u fiziološkoj otopini na 4 C ( ID-DiaCell I-II-III ) Prije uporabe lagano resuspendirajte test stanice. Prije uporabe stavite ID-kartice u hladnjak ( 8 C) na sata. Koristite stanične reagense i uzorke ohlađene u hladnjaku. 1. Označite odgovarajuće mikrostupce ID-kartice jedinstvenim brojem ili drugom oznakom bolesnika ili davatelja, kako je prikladno.. Uklonite aluminijski pokrov s onoliko mikrostupaca koliko trebate držeći ID-karticu u uspravnom položaju. 3. Ukapajte 50 μl svake suspenzije test eritrocita DiaCell I-II-III u odgovarajuće mikrostupce (označene 1 3). 4. Ako se radi autokontrola, ukapajte 50 μl suspenzije eritrocita bolesnika u odgovarajući mikrostupac. 5. Ukapajte po 5 μl plazme ili seruma bolesnika u svaki mikrostupac. 6. Inkubirajte ID-karticu 30 minuta na 8 C. 7. Centrifugirajte ID-karticu 10 minuta u ID-centrifugi. 8. Očitajte i zabilježite rezultate.

5 5 18 B) Identifikacija protutijela I. Enzimatski test s papainiziranim eritrocitima ( ID-DiaPanel P ) Prije uporabe lagano resuspendirajte test stanice. 1. Označite ID-karticu jedinstvenim brojem ili drugom oznakom bolesnika ili davatelja, kako je prikladno.. Uklonite aluminijski pokrov s onoliko mikrostupaca koliko je potrebno, držeći ID-karticu u uspravnom položaju. 3. Ukapajte po 50 μl od svake bočice test eritrocita ID-DiaPanel P (papainiziranih) u odgovarajuće mikrostupce (označene 1 11). 4. Ako se radi autokontrola, ukapajte 50 μl suspenzije eritrocita bolesnika u 1. mikrostupac. 5. Ukapajte po 5 μl plazme ili seruma pacijenta ili davatelja u svaki mikrostupac. 6. Za autokontrolu dodajte 5 μl ID-Papaina u mikrostupac broj Inkubirajte ID-karticu 15 minuta na 37 C u ID-inkubatoru. 8. Centrifugirajte ID-karticu 10 minuta u ID-centrifugi. 9. Očitajte i zabilježite rezultate. 4 C 8 0 µ μl a II. Test u fiziološkoj otopini na 4 C ( ID-DiaPanel ) Prije uporabe lagano resuspendirajte test stanice. Prije uporabe stavite ID-kartice u hladnjak ( 8 C) na sata. Koristite u hladnjaku ohlađene stanične reagense i uzorke. 1. Označite ID-karticu imenom ili brojem bolesnika ili davatelja, kako je prikladno.. Uklonite aluminijski pokrov s onoliko mikrostupaca koliko trebate, držeći karticu u uspravnom položaju. 3. Ukapajte po 50 μl iz svake bočice test eritrocita ID-DiaPanelv u odgovarajuće mikrostupce (označene 1 11). 4. Ako se provodi autokontrola, ukapajte 50 μl suspenzije eritrocita bolesnika u mikrostupac broj Ukapajte po 5 μl plazme ili seruma bolesnika ili davatelja u svaki mikrostupac. 6. Inkubirajte ID-kartice 30 minuta na 8 C. 7. Centrifugirajte ID-karticu 10 minuta u ID-centrifugi. 8. Očitajte i zabilježite rezultate.

6 6 C) Test podudarnosti I. Enzimatski test (papain ili bromelin) 1. Označite ID-karticu jedinstvenim brojem ili drugom oznakom bolesnika ili davatelja, kako je prikladno.. Uklonite aluminijski pokrov s onoliko mikrostupaca koliko trebate, držeći ID-karticu u uspravnom položaju. 3. Ukapajte 50 μl suspenzije eritrocita davatelja u odgovarajuće mikrostupce. 4. Ako se provodi autokontrola, ukapajte 50 μl suspenzije eritrocita bolesnika u odgovarajući mikrostupac. 5. Ukapajte 5 μl plazme ili seruma bolesnika u svaki mikrostupac. 6. Dodajte u svaki mikrostupac po 5 μl ID-Papaina ili ID-Diluenta Inkubirajte ID-karticu 15 minuta na 37 C u ID-inkubatoru. 8. Centrifugirajte ID-karticu 10 minuta u ID-centrifugi. 9. Očitajte i zabilježite rezultate. II. Test u fiziološkoj otopini 1. Označite ID-karticu jedinstvenim brojem ili drugom oznakom bolesnika ili davatelja, kako je prikladno.. Uklonite aluminijski pokrov s onoliko mikrostupaca koliko trebate, držeći ID-karticu u uspravnom položaju. 3. Ukapajte 50 μl suspenzije eritrocita davatelja u odgovarajuće mikrostupce. 4. Ako se provodi autokontrola, ukapajte 50 μl suspenzije eritrocita bolesnika u odgovarajući mikrostupac. 5. Ukapajte po 5 μl plazme ili seruma bolesnika u svaki mikrostupac. 6. Inkubirajte ID-kartice 15 minuta na sobnoj temperaturi (18 5 C). 7. Centrifugirajte ID-karticu 10 minuta u ID-centrifugi. 8. Očitajte i zabilježite rezultate. D) Određivanje ABO protutijela ( ID-DiaCell ABO ) Prije uporabe lagano resuspendirajte test stanice. 1. Označite ID-karticu jedinstvenim brojem ili drugom oznakom bolesnika ili davatelja, kako je prikladno.

7 7 1. Uklonite aluminijski pokrov s onoliko mikrostupaca koliko trebate, držeći karticu u uspravnom položaju. 3. Ukapajte po 50 μl od svake suspenzije ID-DiaCell test stanica (A 1, A, B i O) u odgovarajuće mikrostupce (označene odgovarajućom oznakom test stanica) 4. Ukapajte po 50 μl plazme ili seruma bolesnika ili davatelja u svaki mikrostupac. 5. Preporučljivo je inkubirati ID-kartice 10 minuta na sobnoj temperaturi. 6. Centrifugirajte ID-karticu 10 minuta u ID-centrifugi. 7. Očitajte i zabilježite rezultate. 4 μ a INTERPRETACIJA REZULTATA A) Načelo [3] Pozitivno: aglutinirane stanice čine crvenu crtu na površini gela ili aglutinate raspršene u gelu. Negativno: kompaktni talog stanica na dnu mikrostupca. B) Reakcije za: I. Pretraživanje protutijela Negativna reakcija ukazuje na odsutnost detektibilnih iregularnih protutijela u serumu/plazmi bolesnika ili davatelja. Pozitivna reakcija ukazuje na prisutnost iregularnih protutijela. Unesite uočene reakcije na tablicu antigena. Provjerite da li broj lota test stanica odgovara broju lota navedenom na tablici antigena. Slijedeći obrazac reakcije i konfiguraciju antigena, može se pretpostaviti vrsta prisutnog protutijela. Učinite uobičajene daljnje testove kako bi identificirali protutijelo. Pozitivna reakcija s nekim test stanicama a negativna autokontrola ukazuje na prisutnost specifičnog protutijela. Pozitivna reakcija sa svim test stanicama i pozitivna autokontrola može biti uzrokovana autoprotutijelom. Kad postoji pozitivna reakcija sa svim test stanicama i pozitivna autokontrola, no reakcija s jednom ili s više test stanica pokazuje jače pozitivnu reakciju od autokontrole, uzorak bolesnika treba uputiti na daljnja ispitivanja, kako bi se ispitala moguća prisutnost aloprotutijela.

8 8 II. Identifikacija protutijela Jedna ili više pozitivnih reakcija ukazuje na prisutnost iregularnih protutijela. Unesite uočene reakcije na tablicu antigena. Provjerite da li broj lota test stanica ID-DiaPanel odgovara broju lota navedenom na tablici antigena. Slijedeći obrazac reakcije i konfiguraciju antigena, u većini slučajeva može se odrediti vrsta prisutnog protutijela (autokontrola mora biti negativna). Pozitivna reakcija sa svim test stanicama DiaPanela i negativna autokontrola može biti uzrokovana nespecifičnom reakcijom ili pak može ukazivati na prisutnost aloprotutijela protiv antigena visoke učestalosti. Pozitivna reakcija sa svim test stanicama ID-DiaPanela i pozitivna autokontrola vjerojatno je uzrokovana autoprotutijelom. Ako je pozitivna reakcija sa svim test stanicama ID-DiaPanela i pozitivna autokontrola, no reakcija s jednom ili više test stanica pokazuje reakciju jaču od autokontrole, to može ukazivati na postojanje aloprotutijela te treba učiniti daljnja ispitivanja. Treba napomenuti da enzimatska autoprotutijela mogu slabije reagirati sa stanicama bolesnika u jednostupanjskoj tehnici nego s ID-DiaCell i-ii-iii P (tehnika u dva stupnja). Kao i kod svih postupaka prema GLP pravilima, osjetljivost gore navedenih postupaka treba validirati upotrebom protutijela poznate jakosti. Bio-Rad Anti-D Reference reagens omogućuje redovitu kontrolu svih postupaka otkrivanja protutijela (vidi upute u odgovarajućem pakiranju). Jaka hladna protutijela mogu uzrokovati pozitivne reakcije, posebno u enzimatskom postupku. Mora se provesti potpuno pretraživanje protutijela. Anti-I je česta specifičnost u bolesti hladnih aglutinina. Potvrda specifičnosti može se učiniti s ID-I negative cell.

9 9 18 III. Test podudarnosti Pozitivna reakcija ukazuje na moguću nepodudarnost zbog prisutnosti iregularnih protutijela u serumu ili plazmi primatelja pa je potrebno daljnje testiranje. Negativna reakcija ukazuje da, uz korištenu tehniku, u serumu/plazmi primatelja nema detektibilnih protutijela protiv antigena na stanicama davatelja. Kad rezultati ukazuju na nepodudarnu križnu probu, moraju se učiniti pretraživanje i identifikacija protutijela te provjeriti ABO i RhD krvna grupa i primatelja i davatelja. 4 C 8 0 µ μl a IV. Određivanje ABO protutijela Reakcija s Test stanice A 1 A B O Krvna grupa negativan negativan + do ++++ negativan A + do ++++ ± do ++++ negativan negativan B negativan negativan negativan negativan AB + do ++++ ± do do ++++ negativan O Autokontrolu treba uključiti kada postoji nepodudarnost između ABO krvne grupe određene s test serumima i ABO rezultata dobivnog određivanjem ABO protutijela i/ili kad su sa test stanicama za pretraživanje dobivene neočekivane pozitivne reakcije. Kad postoje nepodudarni rezultati između ABO određivanje krvne grupe i ABO protutijela, konzultirajte Bio-Rad ABO identifikacijsku kartu za prikladne postupke.

10 10 NAPOMENE 1. Ako je u gornjem dijelu mikrostupca zamijećena hemoliza, a uzorak nije hemoliziran, rezultat treba smatrati pozitivnim.. Kod određivanja ABO protutijela, inkubacija na 18 5 C prije centrifugiranja u trajanju od 10 minuta pojačava reakcije, a broj opetovanih testova koje je inače potrebno učiniti zbog slabih izoaglutinina smanjuje se na minimum. OGRANIČENJA a) Kartice s mjehurićima u gelu ili kapljicama u gornjem dijelu mikrostupaca i/ili pokrova treba prije uporabe centrifugirati b) Bakterijska ili druga kontaminacija korištenih materijala može uzrokovati lažno pozitivne ili lažno negativne rezultate. c) Ostaci fibrina u suspenziji eritrocita mogu uhvatiti neaglutinirane stanice, tvoreći finu ružičastu crtu na vrhu gela, dok se većina stanica nakon centrifugiranja nalazi na dnu mikrostupca. d) Neophodno je striktno pridržavanje postupaka i uporaba preporučene opreme. Oprema se treba kontrolirati redovito, prema procedurama GLP (dobre laboratorijske prakse). e) Uporaba drugih otopina za suspenziju, osim ID-Diluenta 1 i, može promijeniti reakcije. f) Upotreba drugih test stanica, osim ID-test stanica, može promijeniti obrasce reakcije. g) Prejaka ili preslaba suspenzija eritrocita može uzrokovati nepravilne rezultate. ZNAČAJKE IZVEDBE Specifičnost/osjetljivost S ID-karticama Enzyme Test and Cold Agglutinins provedene su studije evaluacije izvedbe. Dobiveni rezultati pokazali su da su značajke izvedbe svake primjene kartice u skladu s poljem primjene i usporedive s ostalim odobrenim proizvodima.

11 11 1 Reproducibilnost Reproducibilnost unutar pretrage (ponovljivost) i reproducibilnost između pretraga s ID-karticama NaCI, Enzyme Test and Cold Agglutinins interno su evaluirane. Nisu nađeni lažno pozitivni ni lažno negativni rezultati. Razlike između reakcija kod pozitivnih uzoraka bile su manje od jednog stupnja jakosti reakcije. BIBLIOGRAPHY 1. Mollison, P.L., Engelfriet, C.P. and Contreras, M.: Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10th ed 1997; Blackwell Scientific Publications, Oxford.. Technical Manual; 11th ed. 1993; American Association of Blood Banks. 3. Lapierre, Y., Rigal, D., Adam, J. et al.: The gel test; A new way to detect red cell antigen-antibody reactions. Transfusion 1990; 30: μ a PRODUCTS ID-kartica NaCl, Enzyme Test and Cold Agglutinins 4 x 1...REF x 1...REF x 1...REF x 1...REF Ovi proizvodi imaju zajamčenu aktivnost, kakva je opisana na naljepnici i na listiću s uputama. Proizvođač odbija svu odgovornost proizašlu iz uporabe ili prodaje ovih proizvoda na bilo koji način ili svrhu različitu od ovdje opisane.

12 1 DiaMed GmbH Pra Rond Cressier FR Switzerland Changes to the version are shaded grey.