HercepTest pre farbiaci automat Dako Autostainer

Transcription

1 HercepTest pre farbiaci automat Dako Autostainer Kód č. K vydanie Pre imunocytochemické farbenie. Súprava je určená pre 50 testov (100 sklíčok). ( ) P04455SK_01_K / str. 1/50

2 Obsah Strana Použitie 4 Súhrn a vysvetlenie - prsník 5 Pozadie 5 Charakteristiky 5 Princíp metódy - prsník 5 Činidlá - prsník 6 Dodané materiály 6 Potrebný materiál, ktorý sa nedodáva 7 Skladovanie - prsník 8 Príprava vzoriek - prsník 8 Rezy zaliate v parafíne 8 Spracovanie tkanív pred farbením 8 Bezpečnostné opatrenia - prsník 9 NÁVOD NA POUŽITIE - prsník 10 A. Príprava činidla 10 A.1 Vyhľadávací roztok epitopu 10 A.2 Premývací pufer 10 A.3 Roztok substrát-chromogén (DAB) 10 A.4 Kontrastné farbivo 10 A.5 Montážne médium 11 B. Metódy farbenia vykonávané vo farbiacom automate Autostainer 11 B.1 Poznámky k postupu 11 B.2 Protokol farbenia 11 Kontrola kvality - prsník 14 Interpretácia farbenia - prsník 15 Obmedzenia - prsník 18 Všeobecné obmedzenia 18 Špecifické obmedzenia pre tento výrobok 18 Charakteristiky účinnosti - prsník 19 Pozadie 19 Porovnávacie štúdie 19 Porovnanie ku klinickému skúšobnému testu (CTA). 19 Vierohodnosť 20 Reprodukovateľnosť 21 Imunoreaktivita 21 Riešenie problémov - prsník 22 Súhrn a vysvetlenie - žalúdok 25 Pozadie 25 Charakteristiky 25 Princíp metódy - žalúdok 25 Činidlá - žalúdok 26 Dodané materiály 26 Potrebný materiál, ktorý sa nedodáva 27 Skladovanie - žalúdok 27 Príprava vzoriek - žalúdok 28 Rezy zaliate v parafíne 28 Spracovanie tkanív pred farbením 28 Bezpečnostné opatrenia - žalúdok 29 NÁVOD NA POUŽITIE - žalúdok 30 A. Príprava činidla 30 A.1 Vyhľadávací roztok epitopu 30 A.2 Premývací pufer 30 A.3 Roztok substrát-chromogén (DAB) 30 A.4 Kontrastné farbivo 31 A.5 Montážne médium 31 B. Metódy farbenia vykonávané vo farbiacom automate Autostainer 31 B.1 Poznámky k postupu 31 B.2 Protokol farbenia 33 Kontrola kvality - žalúdok 34 Interpretácia farbenia - žalúdok 36 Obmedzenia - žalúdok 39 ( ) P04455SK_01_K / str. 2/50

3 Všeobecné obmedzenia 39 Špecifické obmedzenia pre tento výrobok 39 Charakteristiky účinnosti - žalúdok 40 Pozadie 40 Reprodukovateľnosť 42 Imunoreaktivita 44 Riešenie problémov - žalúdok 45 Literatúra 48 Vysvetlivky k symbolom 50 ( ) P04455SK_01_K / str. 3/50

4 Použitie Určené na diagnostické použitie in vitro. HercepTest je polokvantitatívny imunocytochemický test pre určenie hyperexpresie proteínu HER2 v tkanive rakoviny prsníka, bežne spracovávaný pre histologické vyhodnotenie a v tlanive rakoviny u pacientov s adenokarcinómom žalúdka vrátanie gastroezofageálneho spojenia, fixovaných vo formalíne a zaliatych v parafíne. HercepTest je indikovaný ako pomôcka pri posudzovaní pacientov, u ktorých sa zvažuje liečba pomocou výrobku Herceptin (trastuzumab) (pozri príbalový leták pre Herceptin ). POZNÁMKA, len pre rakovinu prsníka: Všetci pacienti, ktorí sú zahrnutí v klinickom výskume produktu Herceptin boli vybratí pomocou výskumného imunocytochemického skúšobného testu (CTA). Žiadny z pacientov v tomto výskume nebol vybratý pomocou HercepTest. HercepTest bol porovnaný s CTA na nezávislej súprave vzoriek a bolo zistené, že poskytuje prijateľne zhodné výsledky. Aktuálny vzťah klinických výsledkov HercepTest k Herceptin nebol zistený. POZNÁMKA, len pre rakovinu žalúdka: Všetci pacienti vo fáze III BO18255 (ToGA) štúdie sponzorovanej spoločnosťou Hoffmann-La Roche boli vybraní pomocou testu Dako HercepTest (IHC) a súpravy Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Táto štúdia demonštrovala klinickú využiteľnosť oboch testov určených na stanovenie stavu HER2 u pacientov s neoperovateľným rekurentným a/alebo metastatickým adenokarcinómom žalúdka alebo gastroezofageálneho spojenia s lokálnym rozšírením. Pre aktuálnu sadu, číslo Kód K5207, boli objemy činidiel prispôsobené špeciálne pre používanie vo farbiacom automate Autostainer. Na označenie adenokarcinómu žalúdka vrátane gastroezofageálneho spojenia sa v tomto dokumente používa aj výraz rakovina žalúdka. Aplikácie pre rakovinu prsníka, viď strany Aplikácie pre rakovinu žalúdka, viď strany Dôležité: Všimnite si rozdiely medzi tkanivom rakoviny prsníka a tkanivom rakoviny žalúdka, predovšetkým v častiach Interpretácia zafarbenia. ( ) P04455SK_01_K / str. 4/50

5 Rakovina prsníka Súhrn a vysvetlenie - prsník Pozadie Ľudský gén HER2 (tiež známy ako ERBB2 alebo NEU) kóduje proteín, často nazývaný ako proteín HER2 alebo p185 HER2. Proteín HER2 je membránový receptor tyrozín-kinázy s homológiou k receptoru epidermálneho rastového faktoru (EGFR alebo HER1) (1-8). Proteín HER2 je normálnou súčasťou vylučovania rôznych epitelových typov buniek (8). U časti pacientov s rakovinou prsníka je proteín HER2 vylučovaný nadmerne ako súčasť procesu malígnej transformácie a rastu nádoru (9). Nadmerné vylučovanie proteínu HER2 na povrchu buniek rakoviny prsníka znamená, že by mohli byť cieľom protilátkovej terapie. Herceptin (trastuzumab) je ľudská monoklonálna protilátka (10), ktorá sa viaže s vysokou afinitou na proteín HER2 a bolo preukázané inhibovanie proliferácie ľudských nádorových buniek, ktoré nadmerne vylučujú proteín HER2 in vitro a in vivo (11-13). Charakteristiky HercepTest bol vyvinutý ako alternatíva k výskumnému CTA, používanému v klinických štúdiách s výrobkom Herceptin. Účinnosť testu HercepTest pre určovanie nadmerného vylučovania proteínu HER2 bola vyhodnotená v nezávislej štúdii, ktorá porovnávala výsledky HercepTest k CTA na 548 vzorkách nádorov prsníka, z ktorých žiadny nebol získaný od pacientov, zahrnutých v klinických štúdiách s výrobkom Herceptin. Výsledky ukazujú 79 % zhodu medzi výsledkami oboch výskumov na týchto tkanivových vzorkách. Zhodné údaje taktiež poukazujú, že hodnota 3+ s testom HercepTest sa veľmi pravdepodobne zhoduje s pozitívnou hodnotou v CTA, čo by spĺňalo vstupné kritérium pre test (2+ alebo 3+). Nález 2+ na HercepTest tiež nebol vo vzájomnom vzťahu s výsledkami CTA. Približne 42 % (53/126) s testom HercepTest 2+ výsledkov bolo negatívnych podľa CTA (0 1+), ktoré by sa nesmeli použiť v klinických výskumoch Herceptin. HercepTest sa interpretuje ako negatívny pre nadmerné vylučovanie proteínu HER2 (0 a 1+ intenzita farbenia), slabo pozitívny (2+ intenzita farbenia) a silne pozitívny (3+ intenzita farbenia). HercepTest nie je určený pre poskytovanie prognostických informácií pacientovi a lekárovi a nebol na tento účel overený. Princíp metódy - prsník HercepTest obsahuje činidlá potrebné pre vykonanie imunocytochemickej metódy farbenia v dvoch krokoch pre bežne spracované, v parafíne zaliate vzorky. Po inkubácii s primárnou zajačou protilátkou k ľudskému proteínu HER2 táto súprava využíva okamžite použiteľné vizualizačné činidlo na základe dextranovej technológie. Toto činidlo obsahuje molekuly sekundárneho kozieho anti-zajačieho imunoglobulínu a molekuly chrenovej peroxidázy, naviazanej na spoločný hlavný reťazec dextranového polyméru, a tak eliminuje nutnosť sekvenčnej aplikácie väzby protilátky a protilátky konjugovanej peroxidázou. Krížová reakcia vizualizačného činidla s ľudskými imunoglobulínmi a s fetálnym teľacím sérom bola odstránená absorpciou v pevné fáze. Enzymatická premena následne pridaného chromogénu vedie k vytvoreniu viditeľného reakčného produktu v mieste antigénu. Vzorku je potom možné sfarbiť kontrastným farbivom a zakryť krycím sklíčkom. Výsledky sa vyhodnocujú pomocou svetelného mikroskopu. Kontrolné sklíčka obsahujú tri vo formalíne fixované a v parafíne zaliate ľudské bunkové línie rakoviny prsníka s výsledkom intenzity farbenia 0, 1+ a 3+ a sú k dispozícii pre overenie cyklov farbenia. Intenzita farbenia týchto línií buniek bola v súlade s počtom receptorov na jednu bunku. HercepTest, Kód K5207, je použiteľný pre automatizované farbenie využívajúce farbiaci automat Autostainer. ( ) P04455SK_01_K / str. 5/50

6 Rakovina prsníka Činidlá - prsník Dodané materiály Nižšie uvedené materiály sú dostatočné pre 50 testov (50 sklíčok inkubovaných s primárnou protilátkou k proteínu HER2 a 50 sklíčok inkubovaných príslušným činidlom pre negatívnu kontrolu). Počet testov je založený na použití 200 µl na jeden tkanivový rez (22 mm x 22 mm) z fľaštičiek č. 1, 2, 3 a 4 a roztoku substrát-chromogén (DAB). Súprava poskytuje dostatočný materiál pre max. 15 jednotlivých cyklov farbenia. Fľaštička č. Množstvo 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L Popis Peroxidase-Blocking Reagent: 3 % peroxid vodíka s obsahom 15 mmol/l azidu sodného (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Afinitne izolovaná protilátka, pripravená na použitie. Dodáva sa v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, ktorý obsahuje stabilizujúci proteín. Imunogén: Syntetický C-koncový fragment (intracytoplazmická časť) proteínu HER2, spojený s kľúčovou dierkou limpet hemocyanínu. Špecifičnosť: Proteín HER2. Purifikačná metóda: Protilátka je afinitne izolovaná pomocou imobilizovaného peptidu proteínu HER2. Visualization Reagent: Dextranový polymér konjugovaný s chrenovou peroxidázou a afinitne izolovanými kozími antizajačími imunoglobulínmi. Dodáva sa v Tris-HCl pufri, ktorý obsahuje stabilizujúci proteín a antimikrobiálne činidlo. Negative Control Reagent: Imunoglobulínová frakcia normálneho zajačieho séra pri ekvivalentnej koncentrácii proteínu ako v protilátke na proteín HER2. Dodáva sa v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, ktorý obsahuje stabilizujúci proteín. DAB Buffered Substrate: Substrátový pufrovaný roztok, ph 7,5, ktorý obsahuje < 0,1 % peroxidu vodíka, stabilizátory, posilňovače a antimikrobiálny prostriedok. DAB Chromogen: 5 % chromogénový roztok 3,3'- diaminobenzidinu tetrahydrochloridu. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citrátový pufer s obsahom detergentu. Wash Buffer (10x): Tris/HCl pufer s detergentom a antimikrobiálnym prostriedkom. ( ) P04455SK_01_K / str. 6/50

7 3 x 5 sklíčok Rakovina prsníka Control Slides: Každé sklíčko obsahuje časti troch formalínom fixovaných v parafíne zaliatych bunkových línií rakoviny prsníka, ktoré predstavujú rôzne úrovne vylučovania proteínu HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) a SK-BR-3 (3+). Kontrolné sklíčka boli tepelne spracované pre lepšiu adherenciu rezov k podložným sklíčkam. Akékoľvek ďalšie tepelné ošetrenie kontrolných sklíčok z dôvodu zlepšenia adherencie rezov k podložným sklíčkam môže ovplyvniť výsledky farbenia. POZNÁMKA: Všetky činidlá, vrátane vyhľadávacieho roztoku epitopu a premývacieho puferu sú pripravené špeciálne pre použitie s týmto testom. Pre správne prevedenie testu by ste nemali použiť náhrady s výnimkou premývacieho pufru, kde sa môže použiť roztok Dako, Kód S3006. Potrebný materiál, ktorý sa nedodáva Hydroxid amónny, 15 mol/l zriedený na 37 mmol/l Kontrastné farbivo: Hematoxylin, ako napr. Mayer's Hematoxylin na báze vody, Dako Kód S3301 (viď NÁVOD NA POUŽITIE, A.4) Krycie sklíčka Destilovaná nebo deionizovaná voda (voda k premývaniu) Sušička, schopná udržiavať teplotu najviac 60 C Etanol, neriedený a 95 % Svetelný mikroskop (zväčšenie objektívu 4 40x) Montážne médium, ako napr. Dako Faramount, Kód S3025, alebo Glycergel, Kód C0563 Pozitívne a negatívne tkanivá pre kontroly procesu (viď časť Kontrola kvality) Podložné sklá SuperFrost Plus, potiahnuté poly-l-lysínom alebo Dako Silanized Slides, Kód S3003 (viď Príprava vzoriek) Nádoby alebo kúpele pre farbenie Časovač (umožňujúci intervaly 2 40 minút) Vodný kúpeľ s krytom (schopný udržovať roztok na vyhľadávanie epitopu pri teplote C) Xylen, toluén alebo substitúty xylénu K5207 bol prispôsobený na použitie s Autostainer Immunostaining System, Kód S3400. Prosím prečítajte si užívateľskú príručku pre farbiaci automat, kde nájdete potrebné komponenty pre farbiaci automat. ( ) P04455SK_01_K / str. 7/50

8 Skladovanie - prsník Skladujte pri teplote 2 8 C. Rakovina prsníka Túto súpravu nepoužívajte po uplynutí dátumu, vytlačeného na vonkajšej strane obalu. Ak sa činidlá skladujú za akýchkoľvek iných než v príbalovom letáku uvedených podmienok, musí užívateľ tieto podmienky overiť (14a, 14b). Kontrolné sklíčka sa musia skladovať pri teplote 2 8 C. Neexistujú známky nestability tohto výrobku. Preto je nutné prevádzať pozitívne a negatívne kontroly súčasne so vzorkou pacienta. Ak spozorujete neočakávané zafarbenie, ktoré nie je možné vysvetliť zmenami laboratórnych postupov a máte podozrenie, že sa jedná o problém s HercepTest, obráťte sa na technické služby spoločnosti Dako. Príprava vzoriek - prsník So vzorkami z biopsie musíte zaobchádzať tak, aby uchovali tkanivo pre imunocytochemické farbenie. U všetkých vzoriek by sa mali používať štandardné spôsoby spracovania tkaniva (15). Rezy zaliate v parafíne Tkanivá uchovávané v neutrálnom pufrovanom formalíne alebo fixatíve Bouin sú vhodné pre spracovanie a zaliatie v parafíne bežným spôsobom. Napríklad vzorky z biopsie by mali byť narezané na časti hrúbky 3 alebo 4 mm a na dobu hodín fixované neutrálnym pufrovaným formalínom. Tkanivá sú potom dehydratované v sérii alkoholov a xylénov, nasledované infiltráciou rozpusteným parafínom, udržiavaným do teploty 60 C. Správne zafixované a zaliate tkanivá, vylučujúce proteín HER2 vydržia pred rezaním a umiestnením na podložné sklo neurčitú dobu, pokiaľ sa skladujú na chladnom mieste (15 25 C) (15, 16). V USA, norma Clinical Laboratory Improvement Act z roku 1988 požaduje v 42 CFR (b), aby Laboratórium udržovalo zafarbené sklíčka minimálne desať rokov od dátumu skúšky a udržiavalo bloky vzoriek najmenej dva roky od dátumu skúšok (16). Vzorky tkaniva je nutné narezať na rezy o hrúbke 4 5 µm, namontovať na sklíčka a prirodzene usušiť pri izbovej teplote na minimálne 12 hodín (alebo až do ich uschnutia) alebo pri 37 C cez noc alebo pri 60 C po dobu jednej hodiny. UPOZORNENIE: Nadmerné zahrievanie po dobu viac ako jedna hodina pri 60 C môže viesť k výraznej strate špecifickej membránovej imunoreaktivity spojenej s HER2 (17). Pre uchovanie antigenicity sa musia rezy tkaniva, uložené na sklíčku (SuperFrost Plus, Poly-Llysine alebo silanizované sklíčka) zafarbiť do 4 6 týždňov od narezania, ak sú uchovávané pri izbovej teplote (20 25 C) (18). Sklíčka, požadované pre vyhodnotenie proteínu HER2 a overenie prítomnosti nádoru by mali byť pripravené v rovnakom čase. Odporúča sa najmenej 5 sklíčok, 1 sklíčko pre prítomnosť nádoru, 2 sklíčka pre vyhodnotenie proteínu HER2 (1 pre inkubáciu s fľaštičkou č. 2 a 1 pre inkubáciu s fľaštičkou č. 4) a 2 sklíčka ako záloha. Používanie testu HercepTest TM na dekalcifikovaných vzorkách nebolo overené a neodporúča sa. Prečítajte si dokumentáciu od spoločnosti Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) a referenčné odkazy 15 a 16, kde nájdete ďalšie podrobné informácie o príprave vzoriek. Spracovanie tkanív pred farbením Pre získanie optimálnej účinnosti testu sa musí využiť špecifická metóda získavania epitopu, varenie v 10 mmol/l citrátovom pufri. Roztok vyhľadávania epitopu je súčasťou sady HercepTest. Táto metóda vyžaduje zahriatie časti vzorky, uložených na sklíčkach a ponorených v 10 mmol/l citrátovom pufri (20) v kalibrovanom vodnom kúpeli, ktorý je schopný udržať roztok na odkrytie epitopu na požadovanej teplote (95 99 C). Laboratóriá, sídliace vo vyšších nadmorských výškach musia stanoviť najlepšiu metódu k udržiavaniu potrebnej teploty vodného kúpeľa. Vyhľadávanie cieľa musí prebiehať vo vodnom kúpeli. Iné metódy zahrievania boli testované, ale neposkytli reprodukovateľné výsledky. Bezprostredne po ukončení vyhľadávania epitopu začnite proces farbenia. Odchýlky od opísaného postupu môžu viesť k nesprávnym výsledkom. ( ) P04455SK_01_K / str. 8/50

9 Bezpečnostné opatrenia - prsník 1. Určené na diagnostické použitie in vitro. 2. Určené pre odborníkov. Rakovina prsníka 3. Fľaštička 1, činidlo blokujúci peroxidázu, obsahuje 3 % peroxidu vodíka. Bezpečnostný list pre profesionálnych užívateľov je k dispozícii na požiadanie. 4. Fľaštička 6, DAB chromogén, obsahuje 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride a má označenie: Nebezpečenstvo H350 Môže spôsobiť rakovinu. H341 Podozrenie, že spôsobuje genetické poškodenie. P201 Pred použitím sa oboznámte s osobitnými pokynmi. P280 Noste ochranné rukavice. Noste ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Noste ochranný odev. P308 + P313 V PRÍPADE expozície alebo podozrenia z nej: Vyhľadajte lekársku pomoc/starostlivosť. P405 Uchovávajte uzamknuté. P501 Zneškodnite obsah a nádobu v súlade s miestnymi, regionálnymi, celoštátnymi a medzinárodnými predpismi. Základné pravidlo osoby mladšie ako 18 rokov nesmú s týmto produktom pracovať. Užívatelia musia byť riadne preškolení čo sa týka správneho pracovného postupu, nebezpečných vlastností produktu a nutných bezpečnostných opatrení. Ďalšie informácie nájdete v Bezpečnostnom liste o materiáloch (SDS). 5. Fľaštička 8, premývací pufer, obsahuje 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride a 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. Môže spôsobiť alergickú reakciu. Wash Buffer (10x) má označenie: H319 P280 Pozor P264 P305 + P351 + P338 Spôsobuje vážne podráždenie očí. Noste ochranné rukavice. Noste ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Noste ochranný odev. Po manipulácii si starostlivo umyte ruky. PO ZASIAHNUTÍ OČÍ: Niekoľko minút ich opatrne vyplachujte vodou. Ak používate kontaktné šošovky a ak je to možné, odstráňte ich. Pokračujte vo vyplachovaní. 6. Tento výrobok obsahuje azid sodný (NaN 3 ), ktorý je v čistej forme vysoko toxický. Aj keď koncentrácia azidu sodného vo výrobku nie je klasifikovaná ako nebezpečná, azid sodný môže reagovať s olovom a meďou v odpadovom potrubí a vytvárať vysoko výbušné azidy ťažkých kovov. Pri likvidácii splachujte dostatočným množstvom vody, aby nedochádzalo k usadzovaniu azidov kovov v potrubí (21, 22). 7. Fľaštička 2, 3 a 4 obsahuje materiály živočíšneho pôvodu. Rovnako ako pri každom výrobku biologického pôvodu je nevyhnutné dodržiavať správne postupy pri manipulácii. 8. S kontrolnými sklíčkami pred a po fixácii a so všetkými ostatnými materiálmi, ktoré s nimi príjdu do styku, je nutné manipulovať ako s potenciálne infekčným materiálom a je nutné ich likvidovať v súlade s riadnymi bezpečnostnými opatreniami (23). Nikdy nenaberajte činidlá do pipety ústami a zamedzte kontaktu činidel a vzoriek s kožou a sliznicami. Ak sa činidlá dostanú do kontaktu s citlivými oblasťami, umyte ich dostatočným množstvom vody. ( ) P04455SK_01_K / str. 9/50

10 Rakovina prsníka 9. Minimalizujte mikrobiálnu kontamináciu činidiel, aby nevzniklo nešpecifické zafarbenie. 10. Nedodržanie inkubačnej doby, teploty alebo metódy môže viesť k chybným výsledkom. Nadmerné sušenie po dobu viac ako jedna hodina pri 60 C môže viesť k výraznej strate špecifickej membránovej imunoreaktivity spojenej s HER2 (17). 11. Činidlá sú optimálne nariedené. Ďalšie zriedenie môže viesť k strate antigénového zafarbenia. 12. Všetky činidlá, vrátane vyhľadávacieho roztoku epitopu a premývacieho puferu sú pripravené špeciálne pre použitie s týmto testom. Pre správne prevedenie testu by ste nemali použiť náhrady s výnimkou premývacieho pufru, kde sa môže použiť roztok, Kód S Vizualizačné činidlo a chromogén DAB môžu byť v prípade vystavenia pôsobeniu intenzívneho svetla negatívne ovplyvnené. Neskladujte zložky systému ani neprevádzajte farbenie pri silnom svetle, napríklad pri priamom slnečnom svetle. 14. Používajte osobné ochranné prostriedky, aby nedošlo k zasiahnutiu očí alebo pokožky. Ďalšie informácie nájdete v Bezpečnostnom liste o materiáloch (SDS). 15. Parafínové zvyšky môžu viesť k falošne negatívnym výsledkom. 16. Použitie iných ako odporúčaných objemov činidiel môže viesť k strate viditeľnosti imunologickej reakcie HER2. Rezy tkaniva väčšie než 22 mm x 22 mm budú vyžadovať 2 3 kvapky v objeme 200 µl činidla na 2 3 miesta automatickej aplikácie. NÁVOD NA POUŽITIE - prsník A. Príprava činidla Je vhodné pripraviť pred farbením nasledujúce činidlá: A.1 Vyhľadávací roztok epitopu Rozrieďte pred začiatkom plánovaného farbiaceho postupu dostatočné množstvo roztoku, fľaštička 7 (vyhľadávací roztok epitopu x 10)1:10 pomocou destilovanej alebo deionizovanej vody. Nepoužitý nariedený roztok môžete skladovať počas jedného mesiaca pri teplote 2 8 C. Rozriedený roztok zlikvidujte, ak je zakalený. A.2 Premývací pufer Rozrieďte dostatočné množstvo roztoku fľaštičky 8 (premývací pufer x 10) 1:10 pomocou destilovanej alebo deionizovanej vody pre premývacie kroky. Nepoužitý nariedený pufer môžete skladovať jeden mesiac pri teplote 2 8 C. Pufer zlikvidujte, ak je zakalený. Farbiaci automat je naprogramovaný tak, že opláchne tkanivové rezy po činidle blokujúcom peroxidázou a roztokom so substrátovým chromogénom. Upozorňujeme, že na tieto kroky premývania sa môže použiť destilovaná (alebo deionizovaná) voda alebo premývací pufer. Všetky ostatné premývacie kroky si vyžadujú použitie premývacieho puferu. A.3 Roztok substrát-chromogén (DAB) Pridaním 11 kvapiek (25 30 µl na kvapku) chromogénu DAB z fľaštičky 6 do jednej fľaštičky 5 obsahujúcej pufrovaný substrát DAB (11 ml) a premiešaním pripravíte roztok substrátchromogén. Hotový roztok substrát-chromogén (DAB) je stabilný po dobu približne 5 dní, ak je skladovaný pri 2 8 C. Roztok treba pred použitím r iadne premiešať. Prípadná prítomnosť zrazeniny v roztoku neovplyvní kvalitu farbenia. POZNÁMKA: Farba DAB chromogénu vo fľaštičke 6 sa môže líšiť od čírej až po svetlohnedú levandulovú. To však funkciu tohto produktu neovplyvní. Riediť v súladu s postupom uvedeným v príbalovom letáku. Pridanie príliš veľkého množstva DAB chromogénu do DAB substrátového puferu spôsobí poškodenie pozitívneho signálu. A.4 Kontrastné farbivo Zafarbený výsledný produkt farbiacej reakcie DAB nie je rozpustný v alkohole ani vo vode. Použite hematoxylínové kontrastné farbivo a nastavte jeho intenzitu farbenia na podobnú ( ) P04455SK_01_K / str. 10/50

11 Rakovina prsníka úroveň, ako je znázornená v Dako Pokyny pre interpretáciu testu HercepTest rakovina prsníka. Môže sa použiť hematoxylín, buď na alkoholovej alebo vodnej báze, ako napr. Dako Mayer's Hematoxylin, Kód S3301. Po hematoxylínovom kontrastnom farbení starostlivo opláchnite v destilovanej alebo deionizovanej vode, potom ponorte sklíčka s tkanivami do kúpeľa 37 mmol/l vodného roztoku amoniaku (viď časť B.2, krok 3). Vodný roztok amoniaku (37 mmol/l) sa pripravuje zmiešaním 2,5 ml 15 mol/l (koncentrovaného) hydroxidu amónneho s 1 litrom destilovanej alebo deionizovanej vody. Nevyužitý vodný roztok amoniaku 37 mmol/l môžete skladovať pri izbovej teplote (20 25 C) v utesnenej fľaši až 12 mesiacov. A.5 Montážne médium Odporúčame použiť permanentné upevňovacie médium bez obsahu vody. Vodná montáž je však tiež prípustná. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Kód S3025, alebo Glycergel Mounting Medium, Kód C0563, sa doporučuje pre vodnú montáž. Glycergel pred použitím skvapalnite zahrievaním na približne 40 (±5) C. B. Metódy farbenia vykonávané vo farbiacom automate Autostainer B.1 Poznámky k postupu Užívateľ by si mal tieto pokyny pozorne prečítať a pred použitím sa zoznámiť so všetkými súčasťami a prístrojovým vybavením (viď Bezpečnostné opatrenia). Všetky činidlá by mali byť pred imunologickým farbením zahriate na izbovú teplotu (20 25 C). Podobne aj všetky inkubácie by mali prebiehať pri izbovej teplote. Nedovoľte, aby tkanivové rezy uschli počas zakladania do farbiaceho automatu a počas procesu farbenia. Suché rezy tkanív môžu vykazovať zvýšenie nešpecifického zafarbenia. Ak sa musí proces farbenia prerušiť, sklíčka treba odložiť do puferového kúpeľa po inkubácii primárnej protilátky na dobu do jednej hodiny pri izbovej teplote (20 25 C) bez ovplyvnenia účinnosti farbenia. Odstránenie parafínu a rehydratácia: Pred farbením musia byť sklíčka s tkanivami zbavené parafínu, aby sa odstránilo médium, v ktorom je tkanivo zaliate a aby sa mohlo rehydrovať. Zaistite úplné odstránenie parafínu. Prítomnosť zvyškov zalievacieho média spôsobí zvýšené nešpecifické zafarbenie. Tento krok by sa mal prevádzať pri izbovej teplote (20 25 C). 1. Vložte sklíčka do xylenového kúpeľa a inkubujte počas 5 (±1) minút. Vymeňte kúpeľ a znovu zopakujte postup. 2. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do neriedeného etanolu na 3 (±1) minúty. Vymeňte kúpeľ a znovu zopakujte postup. 3. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do 95 % etanolu na 3 (±1) minúty. Vymeňte kúpeľ a znovu zopakujte postup. 4. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do destilovanej alebo deionizovanej vody na minimálne 30 sekúnd. Začnite postup farbenia, ako je popísané v časti B.2, krok 1, vyhľadávanie epitopu. Roztoky xylénu a alkoholu je nutné vymeniť po 40 sklíčkach. Namiesto xylénu môžete použiť toluén alebo substitúty xylénu, napríklad Histoclear. POZNÁMKA: Činidlá a návody dodané v tejto súprave boli navrhnuté pre optimálnu účinnosť. Ďalšie riedenie činidiel alebo zmena inkubačných teplôt môže viesť k nesprávnym alebo nesúhlasným výsledkom. Rozdiely v spracovaní tkanív a v technických postupoch v laboratóriu užívateľa môžu znehodnotiť výsledky štúdie pre použitie u vybraných pacientov na terapiu Herceptin. B.2 Protokol farbenia Prevedené pri izbovej teplote, C. Krok 1: Vyhľadávanie epitopu Naplňte farbiace nádoby, napr. nádoby Coplin nariedeným roztokom vyhľadávania epitopu (viď NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.1). Vložte farbiace nádoby obsahujúce roztok ( ) P04455SK_01_K / str. 11/50

12 Rakovina prsníka vyhľadávania epitopu do vodného kúpeľa. Zahrejte vodný kúpeľ a roztok vyhľadávania epitopu na C. Ohrievaním sa vzhľad roztoku na odkrytie epitopu stáva zakaleným. Prikryte nádoby viekom, aby sa stabilizovala teplota a aby nedochádzalo k odparovaniu. Ponorte rezy, z ktorých bol odstránený parafín pri izbovej teplote do predhriateho roztoku vyhľadávania epitopu v nádobách na farbenie. ZMEŇTE TEPLOTU VODNÉHO KÚPEĽA A ROZTOKU PRE VYHĽADÁVANIE EPITOPU SPÄŤ NA C. Inkubujte 40 (±1) minút pri teplote C. Vyberte celú nádobu so sklíčkami z vodného kúpeľa. Nechajte sklíčka vychladnúť v roztoku na vyhľadávanie epitopu počas 20 (±1) minút pri izbovej teplote. Zlejte roztok na vyhľadávanie epitopu a opláchnite rezy v premývacom puferi (viď NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2). Pre docielenie lepšieho výsledku máčajte rezy v premývacom puferi počas 5 20 minút po vyhľadávaní epitopu a pred farbením. POZNÁMKA: Roztok vyhľadávania epitopu je určený len pre jednu aplikáciu. Nepoužívajte opakovane. Krok 2: Postup pre farbiaci automat 1. Použite farbiacim automatom vygenerovaný plán autoprogramu HercepTest pre požadované časy programu a objemy činidiel (pozri bod 4 ohľadne špecifických objemov). 2. Vložte fľaštičky s činidlami do stojanu na činidlá v automate podľa plánu pre činidlá vygenrovaného počítačom. 3. Vložte podložné sklá do farbiaceho automatu podľa plánu podložných skiel vygenerovaného počítačom. 4. Nastavte program a spustite program HercepTest. Nasleduje nákres programového cyklu: Opláchnuť 200 µl činidla blokujúceho peroxidázu - 5 minút Opláchnuť 200 µl primárneho anti-her2 proteínu (alebo činidlo negatívnej kontroly) - 30 minút Opláchnuť 200 µl vizualizačné činidlo - 30 minút Opláchnuť Opláchnuť Prepnúť 200 µl substrát-chromogenového roztoku (DAB) - 10 minút Po kroku so substrát-chromogénom opláchnite sklá v deionizovanej vode POZNÁMKA: Farbiaci automat hardvérovej verzie 01 preplachuje sklá v pufri. Z tohto dôvodu je treba sklá po vybratí z automatu prepláchnuť v deionizovanej vode. Krok 3: Kontrastné farbenie (návod pre hematoxylín) Vyberte podložné sklá z farbiaceho automatu a zafarbite ich v hematoxylíne ako je popísané nižšie. Ponorte sklíčka do hematoxylínového kúpeľa. Inkubujte 2 5 minút, v závislosti od koncentrácie použitého hematoxylínu. Opatrne opláchnite vo vodnom kúpeli reagenčnej kvality. Uistite sa, že ste odstránili všetok zostávajúci hematoxylín. ( ) P04455SK_01_K / str. 12/50

13 Rakovina prsníka Voliteľné: Ponorte sklíčka 10krát do kúpeľa 37 mmol/l vodného roztoku amoniaku (viď časť A.4). Opláchnite opatrne sklíčka v kúpeli s destilovanou alebo deionizovanou vodou na 2 5 minút. POZNÁMKA: V závislosti na inkubačnej dobe a potencii použitého hematoxylínu spôsobí kontrastné farbenie bledomodré až tmavomodré zafarbenie bunkových jadier. Prílišné alebo neúplné kontrastné zafarbenie môže ohroziť správnu interpretáciu výsledkov. Krok 4: Montáž Odporúčame použiť permanentné upevňovacie médium bez obsahu vody. Vodná montáž je však tiež prípustná. Vzorky môžu byť namontované a prekryté montážnym médiom na báze vody, napríklad Dako Faramount, Kód S3025 alebo Glycergel, Kód C0563. POZNÁMKA: Sklíčka je možné čítať kedykoľvek je to vhodné. Pokiaľ sú sklíčka počas viac než jedného týždňa prekryté vodným montážnym médiom a vystavené intenzívnemu svetlu, môže dôjsť k určitému vyblednutiu. Z dôvodu minimalizácie vyblednutia skladujte sklíčka v tme a pri izbovej teplote (20 25 C). ( ) P04455SK_01_K / str. 13/50

14 Rakovina prsníka Kontrola kvality - prsník Rozdiely vo fixácii tkanív, spracovaní a zaliatí tkanív v laboratóriu užívateľa môžu spôsobiť výraznú variabilitu výsledkov, ktorá si vyžiada pravidelné prevádzanie vlastných kontrol v spojitosti s kontrolnými sklíčkami, dodávanými Dako. V USA pre ďalšie informácie konzultujte pokyny pre kontrolu kvality certifikačného programu College of American Pathologists (CAP) pre imunohistochémiu, viď tiež CLSI (skôr NCCLS) Quality Assurance pre imunocytochémiu, schválené smernice (24) a referencie 25. Tabuľka 1. Účel dennej kontroly kvality. Tkanivo: Fixované a spracované ako vzorka pacienta Pozitívna kontrola: Tkanivo alebo bunky obsahujúce cieľový antigén, ktorý sa má nájsť (môže sa nachádzať v pacientovom tkanive). Ideálna kontrola je slabo pozitívne zafarbené tkanivo, lebo toto je najcitlivejšie na degradáciu protilátky alebo antigénu. Špecifická protilátka a sekundárna protilátka Kontroluje všetky kroky analýzy. Overuje činidlo a postupy použité pre farbenie proteínu HER2 Nešpecifická protilátka* alebo pufer plus rovnaká sekundárna protilátka ako tá, ktorá bola použitá so špecifickou protilátkou Zistenie nešpecifického farbenia pozadia Negatívna kontrola: Tkanivá a bunky, u ktorých sa očakáva, že budú negatívne (môžu sa nachádzať v pacientovom tkanive alebo pozitívnom kontrolnom tkanive) Zistenie neplánovanej krížovej reaktivity s bunkami/s časťami buniek Zistenie nešpecifického farbenia pozadia Tkanivo pacienta Zistenie špecifického farbenia Zistenie nešpecifického farbenia pozadia Kontrolné sklíčko dodávané Dako Kontroluje iba proces farbenia * Sérum z rovnakých druhov ako špecifická protilátka, avšak nezamerané proti rovnakému cieľovému antigénu. Pre zaznamenanie nešpecifických viazaní protilátok, napr. viazanie Fc časti protilátky tkanivom. Kontrolné sklíčko (dodané): Každé z dodaných kontrolných sklíčok obsahuje tri obalené, formalínom fixované, v parafíne zaliate línie buniek ľudskej rakoviny prsníka s výsledkami intenzity farbenia 0, 1+ a 3+. V každom cykle farbenia by sa malo farbiť jedno sklíčko. Vyhodnotenie bunečných línii na podložných sklíčkach s kontrolnými vzorkami dodaných firmou Dako rozhoduje o platnosti cyklu farbenia. Tkanivo pre pozitívnu kontrolu: Kontrolné vzorky by mali byť čerstvo fixované vzorky z pitvy/biopsie/operácie, spracované a zaliate čo najskôr rovnakým spôsobom ako vzorka (vzorky) pacienta. Pozitívne kontroly tkanív sú známkou správne pripravených tkanív a použitia správnych metód farbenia. Pre každú sadu testovacích podmienok by mala byť v každom cykle farbenia prevedená jedna pozitívna kontrola tkaniva. U tkanív použitých pre pozitívnu kontrolu by sa malo prejaviť mierne zafarbenie, aby mohli tkanivá zaznamenať mierne zmeny v citlivosti primárnej protilátky. Kontrolné sklíčka dodané so súpravou alebo vzorky, vytvorené odlišne od vzorky (vzoriek) pacienta overujú len účinnosť činidla a neoverujú prípravu tkaniva. Použite predtým určený proteín HER2 s intenzitou 2+, nadmieru vylučujúci invazívne (infiltračné) tkanivo ľudskej rakoviny prsníka pre ideálnu pozitívnu kontrolu tkaniva. POZNÁMKA: Známe tkanivá pre pozitívnu kontrolu sa môžu použiť na monitorovanie správneho prevedenia spracovaných tkanív a test činidiel, NIE ako pomoc pri formulácii špecifickej diagnózy vzoriek pacienta. Ak tkanivá pozitívnej kontroly zlyhajú pri preukázaní príslušného pozitívneho sfarbenia, výsledky so vzorkami pacienta by sa mali považovať za neplatné. Tkanivo pre negatívnu kontrolu: Pri každom farbiacom cykle používajte fixované tkanivo pre negatívnu kontrolu (o ktorej vieme, že je proteín HER2 negatívny), spracovanou a zaliatou identickým spôsobom ako vzorka (vzorky) pacienta, aby bola overená špecificita primárnej ( ) P04455SK_01_K / str. 14/50

15 Rakovina prsníka protilátky a aby sa prejavilo špecifické zafarbenie pozadia. Hrubé črevo, pečeň alebo štítna žľaza sú vhodné pre tkanivo negatívnej kontroly. Rozmanitosť rôznych typov buniek, ktoré sa nachádzajú vo väčšine rezov tkaniva, ponúka vnútorné oblasti pre negatívnu kontrolu (to by mal overiť užívateľ). Normálne prsné kanáliky môžu slúžiť ako interné negatívne kontroly. Ak sa v tkanive negatívnej kontroly alebo v tkanive internej negatívnej kontroly vyskytne špecifické zafarbenie, výsledky vzoriek pacienta by sa mali považovať za neplatné a test by sa mal zopakovať. Nešpecifické činidlo negatívnej kontroly: Použite dodané činidlo pre negatívnu kontrolu namiesto primárnej protilátky s rezom každej vzorky pacienta a vyhodnoťte tak nešpecifické zafarbenia a umožnite lepšiu interpretáciu špecifického zafarbenia v oblasti antigénu. Inkubačná doba činidla pre negatívnu kontrolu by mala zodpovedať inkubačnej dobe primárnej protilátky. Overenie testu: Pred prvým použitím protilátky alebo farbiaceho systému v diagnostickej metóde by mal užívateľ overiť špecificitu protilátky tak, že ju vyskúša u niekoľkých sérií v laboratóriu dostupných tkanív so známou imunocytochemickou charakteristikou účinnosti, ktoré predstavujú známe pozitívne a negatívne tkanivá. Zoznámte sa s postupmi pre kontrolu kvality, popísanej v tejto časti príbalového letáku a s požiadavkami pre kontrolu kvality na báze certifikačného programu CAP pre imunohistochémiu alebo CLSI (skôr NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (Schválená smernice CLSI pre zaisťovanie kvality pre imunohistochémiu), (24). Tieto postupy kontroly kvality je treba zopakovať pre každú novú šaržu protilátok, alebo keď nastane zmena v parametroch testu. Prsné karcinómy so známymi intenzitami zafarbenia proteínu HER2 od 0 3+ a negatívne tkanivá, napr. hrubé črevo, pečeň alebo štítna žľaza sú vhodné pre overenie testu. Interpretácia farbenia - prsník Pre determináciu nadmerného vylučovania proteínu HER2 by sa mali vyhodnocovať len membránová intenzita zafarbenia a vzor pomocou rozsahu, uvedeného v tabuľke 2. Sklíčka by mal vyhodnocovať patológ pomocou svetelného mikroskopu. Pre vyhodnotenie imunocytochemického zafarbenia a výsledku je vhodný objektív s 10x zväčšením. Použitie objektívu so zväčšením 20 40x je vhodný pre potvrdenie výsledku. Cytoplazmické zafarbenie treba považovať za nešpecifické zafarbenie a nezahŕňa sa do vyhodnotenia intenzity membránového zafarbenia (8). Pre pomoc v diferenciácii zafarbenia 0, 1+, 2+ a 3+ sa obráťte na Dako Pokyny pre interpretáciu testu HercepTest rakovina prsníka, kde nájdete reprezentatívne obrázky intenzít zafarbenia. Započítať sa môžu len vzorky od pacientov s invazívnym karcinómom prsníka. V prípadoch s karcinómom in situ a invazívnych karcinómov v tej istej vzorke sa započítajú len invazívne zložky. Tabuľka 2. Kritériá intenzity zafarbenia bunkovej membrány. Vzor zafarbenia Nebolo pozorované zafarbenie alebo bolo pozorované membránové zafarbenie v menej ako 10 % buniek nádoru Nepatrné/slabo rozoznateľné membránové zafarbenie bolo zaznamenané u viac ako 10 % buniek nádoru. Bunky sú zafarbené iba v časti ich membrány Slabo až stredne rozoznateľné celkové membránové zafarbenie bolo zaznamenané u viac ako 10 % buniek nádoru. Silné celkové membránové zafarbenie bolo zaznamenané u viac ako 10 % buniek nádoru. Výsledok (hlásiť ošetrujúcemu lekárovi) Hodnotenie nadmerného vylučovania proteínu HER2 (hlásiť ošetrujúcemu lekárovi) Negatívny Negatívny Slabo pozitívne Silno pozitívne HercepTest sa interpretuje ako negatívny pre nadmerné vylučovanie proteínu HER2 (0 a 1+ intenzita farbenia), slabo pozitívny (2+ intenzita farbenia) a silne pozitívny (3+ intenzita ( ) P04455SK_01_K / str. 15/50

16 Rakovina prsníka farbenia). HercepTest nie je určený pre poskytovanie prognostických informácií pacientovi a lekárovi a nebol na tento účel overený. Pre každý cyklus farbenia by mali byť sklíčka skontrolované podľa inštrukcií, uvedených v tabuľke 3, aby sa určila platnosť cyklu sfarbovania a umožnilo semikvantitatívne vyhodnotenie intenzity zafarbenia vzorky tkaniva. Tabuľka 3. Inštrukcie pre vyhodnotenie sklíčka. Inštrukcie pre čítanie sklíčka Odôvodnenie 1. Kontrolné sklíčko, obsahujúce tri línie buniek Prítomnosť 3+ hnedého zafarbenia membrány bunky (lemovanie) v 3+ kontrolnej línii bunky SK-BR-3, čiastočne hnedé lemovanie v 1+ kontrolnej línii bunky MDA-175, a zafarbenie 0 v kontrolnej línii bunky MDA-231 indikuje platný test Bodové a nesúvislé zafarbenie membrány je prítomné v malom až v strednom počte buniek v slabo pozitívnej 1+ kontrolnej línii bunky MDA-175. Tiež akoby bodové imunozafarbenie Golgi oblasti cytoplazmy je možné pozorovať v tejto línii buniek. Prítomnosť hnedého zafarbenia v 0 kontrolnej línii buniek MDA- 231 (negatívne pre zafarbenie proteínu HER2) indikuje, že sa počas testu nevyskytlo nešpecifické zafarbenie. Výsledky testu môžu byť neplatné kvôli nadmernému zafarbeniu. 2. Sklíčka tkaniva pre pozitívnu kontrolu Je možné pozorovať prítomnosť hnedého zafarbenia membrány. Zafarbenie cytoplazmy a negatívnych tkanív nesmie byť viac ako Sklíčka tkaniva pre negatívnu kontrolu ABSENCIA alebo špecifické zafarbenie v sklíčkach pre negatívnu kontrolu tkaniva potvrdzujú nedostatok krížovej reaktivity súpravy k bunkám/bunkovým prvkom. Ak sa špecifické membránové zafarbenie vyskytne v sklíčkach pre negatívnu kontrolu tkaniva, výsledky so vzorkou pacienta treba považovať za neplatné. 4. Sklíčka tkaniva pacienta, zafarbené pomocou činidla negatívnej kontroly 5. Sklíčka tkaniva pacienta, zafarbené pomocou primárnej protilátky Absencia špecifického zafarbenia membrány potvrdzuje špecifické označovanie cieľového antigénu primárnou protilátkou Iné žltohnedé alebo hnedé zafarbenie, vyskytujúce sa v cytoplazme vzorky, spracovanej činidlom negatívnej kontroly, ako je spojivové tkanivo, leukocyty, erytrocyty alebo nekrotické tkanivo treba považovať za nešpecificky zafarbené pozadie a treba ho oznámiť v odseku pre komentáre údajového listu. Ak sa vo vzorke zistí nadmerné vylučovanie proteínu HER2, objaví sa ako hnedé lemovanie na membráne nádorových buniek, ošetrených primárnou protilátkou 1. Kontrolné sklíčko (dodané): Kontrolné sklíčko, zafarbené pomocou HercepTest treba najprv preskúmať, či všetky činidlá správne fungujú. Prítomnosť hnedého (3,3 - diaminobenzidín, DAB) produktu reakcie v membráne bunky indikuje pozitívnu reaktivitu. Prítomnosť obvodového hnedého zafarbenia membrány bunky (lemovanie) v 3+ kontrolnej línii bunky SK-BR-3, čiastočne hnedé lemovanie v 1+ kontrolnej línii bunky MDA-175 a zafarbenie v 0 kontrolnej línii bunky MDA-231 indikuje platný test. Ak nejaká z kontrolných línií bunky je mimo týchto kritérií, všetky výsledky so vzorkou pacienta treba považovať za neplatné. 2. Tkanivo pre pozitívnu kontrolu: Sklíčko tkaniva pre pozitívnu kontrolu treba preskúmať ako nasledujúce. Toto sklíčko potvrdzuje, že fixačná metóda a spôsob vyhľadania epitopu sú efektívne. Používajte neporušené bunky pre interpretáciu výsledkov zafarbenia, pretože nekrotické alebo degenerované bunky sa často zafarbia nešpecificky (26). Zafarbenie musí byť pozorované v nádorovom tkanive ako hnedé zafarbenie membrány bunky. Hnedé zafarbenie cytoplazmy a negatívne tkanivá v rámci vzorky nesmú vykazovať intenzitu sfarbenia viac ako Tkanivo pre negatívnu kontrolu: Sklíčko tkaniva pre negatívnu kontrolu sa musia vyšetriť po tkanivách pre pozitívnu kontrolu, aby sa overila špecifičnosť označenia cieľového antigénu primárnou protilátkou. Absencia špecifického zafarbenia v tkanive pre negatívnu kontrolu potvrdzuje nedostatok krížovej reaktivity súpravy k bunkám/bunkovým prvkom. Ak sa špecifické ( ) P04455SK_01_K / str. 16/50

17 Rakovina prsníka membránové zafarbenie vyskytne v tkanive pre negatívnu kontrolu, výsledky so vzorkou pacienta treba považovať za neplatné. Alternatívne, negatívne časti tkaniva pre pozitívnu kontrolu môžu slúžiť ako tkanivo pre negatívnu kontrolu, ale to musí overiť užívateľ. Zapamätajte si, že slabá reakcia (0 1+ intenzita zafarbenia) sa dá pozorovať u väčšiny normálneho epitelového tkaniva. Možné tkanivá pre negatívnu kontrolu zahŕňajú: hrubé črevo, pečeň a štítnu žľazu. Nešpecifické zafarbenie, ak sa vyskytne, bude mať difúzny vzhľad. Sporadické zafarbenie spojivového tkaniva sa dá tiež pozorovať v rezoch z tkanív, nadmerne fixovaných formalínom Tkanivo pacienta: Nakoniec preskúmajte vzorky pacienta, zafarbené pomocou HercepTest. Pozitívnu intenzitu zafarbenia treba vyhodnocovať v kontexte každého nešpecifického zafarbenia pozadia činidla negatívnej kontroly. Ako pri každom imunocytochemickom teste znamená negatívny výsledok, že antigén nebol zaznamenaný, nie že antigén nie je prítomný v testovaných bunkách/tkanive. Viď časti Súhrn a vysvetlenie, Obmedzenia a Charakteristiky účinnosti pre špecifické informácie ohľadne imunoreaktivity testu HercepTest. Ďalšie odporúčania pre interpretáciu zafarbenia HercepTest Väčšina metastatických karcinómov prsníka, testovaných na nadmerné vylučovanie proteínu HER2 udáva výsledok 0 alebo 3+. Pretože väčšina týchto prípadov sú čisté rezy, malé percento zo zvyšných vzoriek 1+ a 2+ sa dá ťažšie interpretovať. Používajte nasledujúce smernice pre interpretáciu zafarbenia HercepTest vo vašom laboratóriu. Vyhodnoťte línie buniek pre overenie účinnosti testu. Vyhodnoťte sklíčka pre pozitívnu a negatívnu kontrolu. Hematoxylínové a eozínové (H&E) zafarbenie vzoriek tkaniva sa doporučuje pre prvé vyhodnotenie. (Nádor nemôže byť viditeľný pri pohľade na vzorku, zafarbenú pomocou HercepTest. Pre overenie prítomnosti nádoru patológom sa vyžaduje H&E zafarbené sklíčko.). HercepTest TM musí byť prevedený na párovanom rezu (sériové rezy) z rovnakého parafínového bloku vzorky. Najprv vyhodnoťte zafarbené rezy na nadmerné vylučovanie proteínu HER2 pri nízkej intenzite. Väčšina pozitívnych prípadov bude zreteľná pri slabom zväčšení. Dobre zachovalé a dobre zafarbené oblasti vzorky treba použiť na určenie percenta pozitívnych buniek nádoru. Vo všeobecnosti výsledok prípadov musí zreteľný pri slabom zväčšení. Ak je určenie medzi hraničnými prípadmi 1+/2+ obťažne pri slabom zväčšení, výsledok je zvyčajne 1+. Pre overenie zafarbenia membrány použite objektív so zväčšením 20 40x. Ak väčšina buniek nádoru vykazuje úplné zafarbenie membrány, zafarbenie je buď 2+ alebo 3+. Pre potvrdenie výsledku použite objektív so zväčšením 20 40x. Vo väčšine prípadov 3+, najmenej 80 % nádorových buniek je zafarbených a zafarbenie membrány je intenzívne. Ak je vo vzorke v blízkosti rezu 10 % pozitívnych nádorových buniek, odporúča sa započítať najmenej 100 nádorových buniek pre určenie percenta zafarbených buniek. Ak je kompletné zafarbenie membrány slabej alebo strednej intenzity u viac ako 10 % nádorových buniek, výsledok vzorky je 2+. To je zvyčajne sprevádzané neúplným zafarbením membrány väčšiny zostávajúcich nádorových buniek. Ak menej ako 10 % nádorových buniek má úplné obvodové zafarbenie membrány, ostatné nádorové bunky môžu vykazovať neúplné zafarbenie membrány, výsledok je 1+. Ak menej ako 10 % nádorových buniek má úplné alebo neúplné obvodové zafarbenie membrány, výsledok je 0. ( ) P04455SK_01_K / str. 17/50

18 Obmedzenia - prsník Rakovina prsníka Všeobecné obmedzenia 1. Imunocytochémia je diagnostický proces, ktorý si vyžaduje špecializované vyškolenie vo výbere vhodných činidiel, výbere tkanív, fixácii a spracovaní; príprave imunocytochemického sklíčka a interpretácii výsledkov zafarbenia. 2. Zafarbenie tkaniva závisí od manipulácie s tkanivom a od jeho spracovania pred farbením. Nesprávna fixácia, zmrazenie, rozmrazenie, umývanie, sušenie, zahrievanie, rezanie alebo kontaminácia inými tkanivami alebo tekutinami môže viesť k vzniku artefaktov, zachyteniu protilátky alebo nesprávnym negatívnym výsledkom. Výsledky môžu byť nekonzistentné v dôsledku použitia rôznych metód fixácie a zaliatia alebo v dôsledku vnútorných nepravidelností v tkanive. 3. Prílišné alebo neúplné kontrastné zafarbenie môže ohroziť správnu interpretáciu výsledkov. 4. Klinická interpretácia ktoréhokoľvek pozitívneho zafarbenia alebo jeho absencie sa musí vyhodnotiť v kontexte klinickej prezentácie, morfológie a iných histopatologických kritérií. Klinická interpretácia ktoréhokoľvek zafarbenia alebo jeho absencie musí byť doplnená morfologickou štúdiou a správnymi kontrolami, ako sú iné diagnostické testy. Je zodpovednosťou kvalifikovaného patológa, oboznámeného z protilátkami, činidlami a používanými metódami, interpretovať zafarbenú vzorku. Zafarbenie sa musí prevádzať v certifikovanom, licencovanom laboratóriu pod dozorom patológa, zodpovedného za vyhodnotenie zafarbených sklíčok a za určenie primeranosti pozitívnej a negatívnej kontroly. 5. Tkanivá osôb, nakazených vírusom hepatitídy B a obsahujúce povrchový antigen hepatitídy B (HBsAg) môžu vykazovať nešpecifické zafarbenie s chrenovou peroxidázou (27). 6. Činidlá môžu vykázať nečakané reakcie v predtým netestovaných typoch tkaniva. Možnosť nečakaných reakcií ani v testovaných typoch tkaniva nemôže byť úplne eliminovaná kvôli biologickej variabilite vylučovania antigénu v novotvaroch alebo iných patologických tkanivách (28). So zdokumentovanou nečakanou reakciou sa obráťte na technický servis spoločnosti Dako. 7. Nesprávne pozitívne výsledky sa môžu vyskytovať v dôsledku neimunologickej väzby proteínov alebo produktov reakcie so substrátom. Môžu byť tiež spôsobené aktivitou pseudoperoxidázy (erytrocyty) a endogénnou aktivitou peroxidázy (cytochrom C) (28). 8. Proces zafarbovania treba prevádzať pri teplote okolia C. Špecifické obmedzenia pre tento výrobok 1. Antigén, prítomný v 1+ kontrolnej línii buniek MDA-175 sa časom znehodnocuje. Vyhodnotenie výsledkov kontrolného sklíčka v spojení s dátumom expirácie kontrolného sklíčka. Negatívne zafarbenie buniek MDA-175 môže znamenať iba to, že kontrolné sklíčko bolo znehodnotené. Kontrolné sklíčka sa musia skladovať pri teplote 2 8 C. 2. Nesprávne negatívne výsledky môžu byť spôsobené časovým znehodnotením antigénu v tkanivách. Vzorky sa musia zafarbiť počas 4 6 týždňov od montáže tkaniva na sklíčka, ak boli skladované pri izbovej teplote (20 25 C) (29). 3. Pre optimálne reprodukovateľné výsledky, proteín HER2 vyžaduje vyhľadávanie epitopu indukované teplotou, ak sú tkanivá bežne zafixované (neutrálne puferovaný formalín alebo fixatív Bouina) a zaliate v parafíne. Toto predbežné spracovanie treba vykonať na začiatku celého procesu zafarbenia. Inštrukcie viď časť Príprava vzoriek, Spracovanie tkanív pred farbením. 4. Teplom navodené vyhľadávanie epitopu proteínu HER2 sa musí používať len s kalibrovaným vodným kúpeľom. Iné metódy zahrievania boli testované, ale neposkytli reprodukovateľné výsledky. ( ) P04455SK_01_K / str. 18/50

19 Rakovina prsníka 5. Nenahrádzajte činidlá súpravy činidlami s inými číslami kódov alebo činidlami od iných výrobcov. Jedinou výnimkou je premývací pufer, ktorý môžete nahradiť pufrom Dako Wash Buffer, kód č. S Nesprávne výsledky môžete získať vyhodnotením cytoplazmického zafarbenia. Pri interpretácii výsledkov berte do úvahy len intenzitu zafarbenia membrány buniek. 7. Zafarbené kontrolné sklíčka sa musia použiť len na vyhodnotenie cyklu zafarbenia a nesmú sa použiť ako doplnok výsledku reakcie zafarbenia v rezoch tkaniva. 8. Silné fokálne zafarbenie (3+), napr. horúce body, sa môžu príležitostne objaviť. Môže to byť výsledkom nerovnej fixácie alebo spracovania tkaniva. Odporúča sa imunologické zafarbenie druhého bloku tkaniva tej istej vzorky. 9. Použitie HercepTest na vzorkách fixovaných v iných fixatívoch ako neutrálne puferovaný formalín alebo fixatív Bouin s nebolo overené. 10. Normálny epitel v tkanive prsníka sa musí zafarbiť medzi 0 a 1+. Ak zaznamenáte zafarbenie normálneho epitelu vyššie ako 1+, test treba zopakovať. Zapamätajte si, že normálna tonzila a ezofageálny epitel sa môže zafarbiť až do intenzity 2+. Charakteristiky účinnosti - prsník Pozadie Klinický skúšobný test (CTA) používaný na identifikáciu vhodných pacientov pre klinické štúdie s výrobkom Herceptin bol pre výskumné použitie a nie je viac dostupný. HercepTest bol vyvinutý pre poskytovanie porovnateľnej alternatívy k CTA. Bezpečnosť a efektívnosť výrobku Herceptin bola vyhodnotená v náhodne vybratých klinických skúškach a veľkom, otvorene označenom teste (viď príbalový leták Herceptin ). Všetci pacienti, vybratí pre klinické testy s výrobkom Herceptin vykazovali nadmerné vylučovanie proteínu HER2 pri imunocytochemickom testovaní, prevádzanom s CTA v centrálnom laboratóriu. Pacienti boli vhodní pre Herceptin terapiu, ak ich nádor vykazoval úrovne 2+ alebo 3+ nadmerného vylučovania proteínu HER2 (založené na rozsahu 0 3+, kde 3+ reprezentuje najvyššiu úroveň). Podskupina analýz výsledkov týchto štúdií predpokladá, že pacienti, ktorých tkanivá sú silne pozitívne (3+) na nadmerné vylučovanie proteínu HER2, môžu získať viac od výrobku Herceptin ako pacienti, ktorých tkanivá sú slabo pozitívne (2+). Stupeň nadmerného vylučovania proteínu HER2 je potenciálne dôležitý ukazovateľ efektívnosti terapie s výrobkom Herceptin. Pretože žiadny z pacientov v štúdiách s výrobkom Herceptin nebol vybratý pomocou HercepTest, vzťah medzi stupňom pozitívnosti a pravdepodobnosť klinického zisku z terapie Herceptin nie je známa. Porovnávacie štúdie Pre charakterizovanie HercepTest boli vykonané dve štúdie. 1) Porovnanie ku klinickému skúšobnému testu (CTA). 2) Presnosť pri porovnaní s piatimi ďalšími testami. Porovnanie ku klinickému skúšobnému testu (CTA) HercepTest bol porovnaný s CTA, ktorý sa používal na identifikáciu vhodných pacientov pre terapiu s výrobkom Herceptin pomocou 274 na proteín HER2 pozitívnych (2+ alebo 3+) a rovnakého počtu na proteín HER2 negatívnych vzoriek tkaniva rakoviny prsníka. Tabuľka 4 znázorňuje výsledky v diagrame veľkosti 2 x 2, kde 0 a 1+ sa považujú za negatívne a 2+ a 3+ za pozitívne. ( ) P04455SK_01_K / str. 19/50

20 Rakovina prsníka Tabuľka 4. 2 x 2 zhodnosť testu HercepTest ku klinickému skúšobnému testu (počet vzoriek). Klinický test Pozitívny Negatívny Celkom HercepTest Pozitívny Negatívny Celkom Zhoda: 79 % (76 82 %) 95 % interval spoľahlivosti. Celková binárna zhoda HercepTest a CTA bola 79 % (431/548), s 2-stranným 95 % intervalom spoľahlivosti %. Dvadsaťjeden percent (21 %) výsledkov nebolo v týchto dvoch metódach zhodných. Výsledky testu HercepTest sa interpretujú na stupnici 0 3+ ako negatívne pre nadmerné vylučovanie proteínu HER2 (0 a 1+ intenzita farbenia), slabo pozitívne (2+ intenzita farbenia) a silne pozitívne (3+ intenzita farbenia). Tabuľka 5. 3 x 3 zhodnosť testu HercepTest a klinického skúšobného testu. Klinický test Celkom HercepTest Celkom Táto 3 x 3 prezentácia porovnávacej štúdie indikuje, že výsledky 3+ v testu HercepTest sú vysokosúhlasné s pozitívnym výsledkom CTA, ktorý splnil vstupné kritériá pre test Herceptin (2+ alebo 3+). Nález 2+ na HercepTest tiež nebol vo vzájomnom vzťahu s výsledkami CTA. Približne 42 % (53/126) s testem HercepTest 2+ výsledkov bolo negatívnych podľa CTA (0 1+), ktoré by sa nesmeli použiť v klinických výskumoch Herceptin. Vierohodnosť HercepTest bol tiež testovaný na 2 mikroskopických sklíčkach, obsahujúcich v parafíne zaliate rezy tkaniva zo 168 nádorov prsníka. Tieto nádory boli predtým charakterizované piatimi rôznymi metódami určovania HER2 génového zosilnenia a nadmerného vylučovania proteínu HER2, vrátane vlastnej analýzy Southern blot, fluorescencie hybridizácie in situ (FISH) pre zosilnenie DNA, analýzy RNA Northern blot, Western blot a imunocytochémie (ICC) na zmrazených tkanivách (29). Výsledky sú uvedené v tabuľke 6. Tabuľka 6. Porovnanie HercepTest a kombinovaných výsledkov (OE) z génového zosilnenia a testov nadmerného vylučovania proteínu HER2. Referencie klasifikácie OE + - Celkom HercepTest Celkom Pozitívna zhoda: 43/69 = 62 % Negatívna zhoda: 99/99 = 100% Výsledky indikovali 85 % (142/168) úroveň zhody (95 % interval spoľahlivosti %) medzi pozitívnosťou (2+ a 3+) a negatívnosťou (0 a 1+) intenzity zafarbenia pomocou HercepTest. Žiadna z negatívnych vzoriek pri 5 rôznych metódach nebola pozitívna pri HercepTest, kde kombinované výsledky 5 rôznych metód ukazujú vysoký počet pozitívnych prípadov. ( ) P04455SK_01_K / str. 20/50

21 Reprodukovateľnosť Rakovina prsníka Reprodukovateľnosť vo vnútri cyklu: Reprodukovateľnosť vo vnútri cyklu bola testovaná v laboratóriu s piatimi vzorkami o rôznej intenzite ICC výsledku zafarbenia. Každá vzorka prebiehala v trojnásobnom cykle v maskovanom náhodnom formáte. Tento protokol bol použitý pri automatickom farbení. Všetky vzorky udávali 100 % reprodukovateľné výsledky. Reprodukovateľnosť medzi cyklami: Reprodukovateľnosť medzi cyklami bola testovaná v troch laboratóriách počas 4 dní s 5 vzorkami rôznej intenzite ICC výsledkov zafarbenia, náhodne vybratých a maskovaných s použitím automatizovanej metodológie. Ukázala sa výborná reprodukovateľnosť pre pozitívne verzus negatívne výsledky (0 a 1+ vs. 2+ a 3+) s výnimkou dvoch vzoriek v jednom laboratóriu, používajúcom automatizovanú metodológiu, ktorá kolísala medzi 1+ a 2+. Bola tam 100 % reprodukovateľnosť pre vzorky 2+ a 3+. Reprodukovateľnosť medzi laboratóriami: Reprodukovateľnosť medzi laboratóriami bola testovaná v troch zemepisne oddelených laboratóriách s 40 identickými náhodne vybratými a maskovanými vzorkami rôznych výsledkov intenzity zafarbenia ICC. Sklíčka čerstvých rezov boli dopravené do každého skúšobného laboratória pre automatizované zafarbenie a vyhodnotenie patológom. Percento medzilaboratórnej zhody sa pohybuje od 83 % do 90 % pre dichotomicky pozitívne/negatívne určenie, kde 0 a 1+ boli negatívne a 2+ a 3+ boli pozitívne na nadmerné vylučovanie proteínu HER2. V porovnaní s výsledkami, získanými v referenčnom laboratóriu, ktoré previedlo CTA, 12,5 % (15/120) porovnávaných výsledkov bolo odlišných medzi negatívnymi (0 alebo 1+) a pozitívnymi (2+ alebo 3+) vyhodnoteniami. Ďalších 10 % (12/120) sa líšilo vo výsledkoch medzi 2+ a 3+. Imunoreaktivita Tabuľka 7 sumarizuje HercepTest imunoreaktivitu s doporučeným panelom normálnych tkanív. Všetky tkanivá boli fixované formalínom a zaliate parafínom a zafarbené pomocou HercepTest podľa pokynov v príbalovom letáku. Tabuľka 7. Súhrn reaktivity HercepTest normálneho tkaniva Typ tkaniva (počet testovaných) Nadoblička (3) Kostná dreň (3) Mozog/Cerebellum (3) Mozog/Cerebellum (3) Prsia (3) Krčok maternice (3) Hrubé črevo (3) Ezofág (3) Srdce (3) Oblička (3) Pečeň (3) Pľúca (3) Mezoteliálne bunky (3) Vaječníky (3) Pankreas (3) Paratyroid (3) Periférne nervy (3) Hypofýza (3) Prostata (3) Slinná žľaza (3) Kostrové svalstvo (3) Pokožka (3) Tenké črevo (3) Slezina (3) Žalúdok (3) Semenníky Týmus (3) Štítna žľaza (3) Tonzila (3) Maternica (3) Pozitívny prvok zafarbenia tkaniva a vzor zafarbenia Mliečna žľaza (2 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, < 5 % buniek) Epitelové bunky (1 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, < 5 % buniek, membránové a cytoplazmatické, zrnité) Folikulárne epitelové bunky (1 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, < 5 % buniek, membránové a cytoplazmatické) Skvamózny epitel (1 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, < 5 % buniek. 2 z 3 tkanív, 2+ intenzita zafarbenia, % buniek. Membránové a cytoplazmatické) Endometriálne tkanino (2 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, % buniek, cytoplazmatické, zrnité) ( ) P04455SK_01_K / str. 21/50

22 U všetkých tkanív sa zisťovalo zafarbenie membrány, ak nie je uvedené inak. Všetky tri vzorky každého typu tkaniva mali rovnakú intenzitu zafarbenia, pokiaľ nie je uvedené inak. Rakovina prsníka Riešenie problémov - prsník Informácie o ďalších riešeniach problémov nájdete v už spomenutej príručke Dako (19) alebo kontaktujte oddelenie technického servisu Dako pre oznámenie nezvyčajného zafarbenia. Problém Pravdepodobná príčina Odporúčaný postup 1. Nedochádza k farbeniu sklíčok. 2. Sklíčka sú slabo zafarbené. 1a. Chyba programovania. Činidlá nie sú použité v správnom poradí. 1b. Fľaštičky s činidlami neboli správne založené do stojanu na činidlá 1c. Nedostatok činidla vo fľaštičke 1d. Azid sodný v premývacom roztoku 1e. Nadmerné zahrievanie namontovaných rezov tkaniva pred odstránením parafínu a pred tepelne indukovaným vyhľadávaním epitopu môže viesť k strate viditeľnosti imunoreaktivity HER2. 2a. Neprimerané vyhľadávanie epitopu 2b. Neprimerané inkubačné doby činidla 2c. Bol použitý nevhodný spôsob fixácie 2d. Nadmerné zahrievanie namontovaných rezov tkaniva pred odstránením parafínu a pred tepelne indukovaným vyhľadávaním epitopu môže viesť k výraznému zníženiu viditeľnosti imunoreaktivity HER2. 1a. Skontrolujte programovú kartičku, aby ste overili, či bol proces farbenia naprogramovaný správne 1b. Skontrolujte plán pre činidlá, aby ste overili správne umiestnenie fľaštičiek 1c. Zabezpečte, aby bolo dosť činidla v fľaštičke pred začatím procesu. Prečítajte si plán činidiel ohľadne potrebného objemu 1d. Použite čerstvo pripravený premývací pufer, ktorý je súčasťou sady 1e. Tkanivové rezy nechajte buď prirodzene usušiť pri izbovej teplote na minimálne 12 hodín alebo až do ich uschnutia. Prípadne ich môžete sušiť pri 37 C cez noc alebo pri 60 C po dobu maximálne jednej hodiny. Sušenie rezov tkaniva pri vyšších teplotách je možné vykonávať len v kalibrovanej sušiarni s rovnomernou distribúciou tepla (17). 2a. Skontrolujte, či roztok pre vyhľadávanie epitopu bol zahrievaný na C po celú dobu 40 minút a či chladol po dobu ďalších 20 minút 2b. Prezrite si pokyny pre postup zafarbenia 2c. Skontrolujte, či nie je tkanivo pacienta príliš fixované a či je použitý schválený fixačný prostriedok 2d. Tkanivové rezy nechajte buď prirodzene usušiť pri izbovej teplote na minimálne 12 hodín alebo až do ich uschnutia. Prípadne ich môžete sušiť pri 37 C cez noc alebo pri 60 C po dobu maximálne jednej hodiny. Sušenie rezov tkaniva pri vyšších teplotách je možné vykonávať len v kalibrovanej sušiarni s rovnomernou ( ) P04455SK_01_K / str. 22/50

23 Rakovina prsníka 3. Prílišné zafarbenie pozadia sklíčok. 2e. Bol aplikovaný nedostatočný objem činidla 3a. Parafín nie je odstránený úplne 3b. Pri montáži rezov na sklíčka sa použili škrobové prísady 3c. Sklíčka nie sú dôkladne opláchnuté 3d. Pri postupe farbení došlo k vysušeniu rezov 3e. Rezy vyschli pri nakladaní do farbiaceho automatu 3f. Bol použitý nevhodný spôsob fixácie 3g. Nešpecifická väzba činidiel k tkanivu distribúciou tepla (17). 2e. Skontrolujte veľkosť tkanivového rezu (22 mm x 22 mm) a objem aplikovaného činidla 3a. Používajte čerstvé čisté roztoky, postupujte podľa návodu uvedeného v časti B.1 3b. Pre lepenie rezov na sklíčka nepoužívajte prísady. Mnohé prísady sú imunoreaktívne 3c. Zabezpečte, aby bol farbiaci automat správne naplnený pred chodom. Skontrolujte, či je dosť pufru pre celý cyklus. Používajte čerstvé roztoky pufrov a premývacích roztokov 3d. Skontrolujte, či bol použitý primeraný objem činidla na podložné sklá. Skontrolujte, či farbiaci automat pracuje s vrchnákom v zatvorenej polohe a či nie je vystavený nadmernému teplu alebo prievanu 3e. Zabezpečte, aby zostali rezy v pufri počas nakladania a pred začatím chodu 3f. Skontrolujte, či bolo použité doporučené fixatívum. Iné fixatíva môžu zapríčiniť prílišné zafarbenie pozadia 3g. Skontrolujte, či je vzorka dobre fixovaná alebo či sa u nej nevyskytuje nekróza 4. Tkanivo sa oddeľuje od sklíčok 4a. Použitie nesprávnych sklíčok 4a. Používajte silanizované sklíčka, napríklad silanizované sklíčka Dako Silanized Slides, Kód S3003, SuperFrost Plus alebo poly-llysínom potiahnuté sklíčka 5. Príliš silné špecifické zafarbenie 5a. Bol použitý nevhodný spôsob fixácie 5b. Použitie nesprávneho tepelného zdroja vyhľadávania epitopu, napr. vyvíjač pary, mikrovlnná rúra alebo autokláv 5c. Inkubačné doby činidla sú príliš dlhé 5d. Bol použitý nevhodný premývací roztok 5a. Dohliadnite, aby boli použité len schválené spôsoby fixácie. 5b. Dohliadnite, aby bol použitý vodný kúpeľ pre vyhľadávanie epitopu 5c. Prezrite si pokyny pre postup zafarbenia 5d. Používajte len premývací roztok doporučený pre použitie s touto súpravou. ( ) P04455SK_01_K / str. 23/50

24 6. Slabé zafarbenie 1+ kontrolného sklíčka línie buniek 7. Roztok na odkrytie epitopu je zakalený pri zohrievaní 8. Roztok na odkrytie epitopu je zakalený počas skladovania (pred zohrievaním) 6a. Postupovalo sa podľa nesprávneho protokolu vyhľadávania epitopu 6b. Nedostatok reakcie s roztokom substrát-chromogén (DAB) 6c. Znehodnotenie kontrolného sklíčka 7. Pri zahrievaní sa roztok stáva zakaleným 8. Roztok nebol správne skladovaný alebo uplynul dátum exspirácie roztoku Rakovina prsníka 6a. Ponorte sklíčko do predhriateho roztoku na vyhľadávanie epitopu. Uveďte teplotu roztoku pre vyhľadávanie epitopu späť na C a predbežne spracovávajte celých 40 minút 6b. Zaistite, že sa využilo plných 10 minút inkubačnej doby. Zaistite, že len jedna kvapka DAB chromogénu bola pridaná k 1 ml puferovaného substrátu DAB 6c. Skontrolujte dátum expirácie a skladovacie podmienky súpravy na vonkajšej strane obalu 7. Ide o normálny jav, ktorý nemá žiadny vplyv na zafarbenie 8. Skontrolujte dátum exspirácie a skladovacie podmienky súpravy na vonkajšej strane obalu. Zlikvidujte roztok na odkrytie epitopu POZNÁMKA: Ak nie je možné za príčinu problému považovať žiadnu z uvedených príčin alebo pokiaľ sa nepodarí problém vyriešiť doporučeným postupom, obráťte sa so žiadosťou o pomoc na Dako technickú podporu. Ďalšie informácie o technikách farbenia a prípravy vzoriek môžete nájsť v predtým spomínanej príručke Dako (19) (dostupná u Dako), Atlas imunohistológie (30) a techniky imunoperoxidázy. Praktický prístup k diagnostike nádorov (31). ( ) P04455SK_01_K / str. 24/50

25 Rakovina žalúdka Súhrn a vysvetlenie - žalúdok Pozadie Ľudský gén HER2 (tiež známy ako ERBB2 alebo NEU) kóduje proteín, často nazývaný ako proteín HER2 alebo p185 HER2. Proteín HER2 je membránový receptor tyrozín-kinázy s homológiou k receptoru epidermálneho rastového faktoru (EGFR alebo HER1) (1-8). Proteín HER2 je normálnou súčasťou vylučovania rôznych epitelových typov buniek (8). Nadmerné vylučovanie proteínu HER2 a génového zosilnenia HER2 v rakovine žalúdka bola preukázaná v mnohých štúdiách (32). Pozitívnosť HER2 je možné detegovať približně v 20% pacientov pomocou IHC alebo FISH (32). Predbežné klinické štúdie in vitro a in vivo preukázali, že trastuzumab (Herceptin ) je účinný u rôznych druhov rakoviny žalúdka, a preto ich výsledky viedli k zahájeniu niekoľkých klinických štúdií (32 36). V štúdii BO18255, fáza III, v rámci testu ToGA, boli HER2-pozitívni pacienti s lokálne pokročilým rekurentným a/alebo metastatickým adenokarcinómom žalúdka alebo gastroezofageálneho spojenia randomizovaní do skupín, v ktorých dostávali 5-FU alebo capecitabin a cisplatinu, a to samostatne alebo v kombinácii s trastuzumabom. Štatisticky významný prínos vyjadrený celkovou dobou prežitia (overall survival, OS) bol preukázaný u pacientov liečených kombinovanou liečbou trastuzumabom a chemoterapiou (37, 38). Herceptin (trastuzumab) je ľudská monoklonálna protilátka, ktorá sa viaže s vysokou afinitou na proteín HER2 a bolo preukázané inhibovanie proliferácie ľudských nádorových buniek, ktoré nadmerne vylučujú proteín HER2 in vitro a in vivo (33 36). Charakteristiky pacientov bolo podrobených skríningu stavu HER2 za účelom ich ďalšieho zaradenia do testu ToGA. V tejto štúdii bolo hodnotené nadmerné vylučovanie proteínu HER2 pomocou IHC (HercepTest, Dako) ako aj génová amplifikácia HER2 FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako) u všetkých pacientov. Platné výsledky testov boli získané v prípade vzoriek, a to pomocou testu IHC alebo FISH a v prípade vzoriek u oboch testov. Výsledky štúdie ToGA ukázali, že 22,1 % pacientov s rakovinou žalúdka v pokročilom štádiu bolo na základe testu IHC alebo FISH a podľa definícií jednotlivých kritérií ToGA HER2 (38), HER2- pozitívnych. Viac informácií ohľadom použitia výrobku HercepTest pri hodnoteniu pacientov, u ktorých sa zvažuje liečba trastuzumabem, nájdete v príbalovom letáku pre Herceptin. Princíp metódy - žalúdok HercepTest obsahuje činidlá potrebné pre vykonanie imunocytochemickej metódy farbenia v dvoch krokoch pre bežne spracované, v parafíne zaliate vzorky. Po inkubácii s primárnou zajačou protilátkou k ľudskému proteínu HER2 táto súprava využíva okamžite použiteľné vizualizačné činidlo na základe dextranovej technológie. Toto činidlo obsahuje molekuly sekundárneho kozieho anti-zajačieho imunoglobulínu a molekuly chrenovej peroxidázy, naviazanej na spoločný hlavný reťazec dextranového polyméru, a tak eliminuje nutnosť sekvenčnej aplikácie väzby protilátky a protilátky konjugovanej peroxidázou. Krížová reakcia vizualizačného činidla s ľudskými imunoglobulínmi a s fetálnym teľacím sérom bola odstránená absorpciou v pevné fáze. Enzymatická premena následne pridaného chromogénu vedie k vytvoreniu viditeľného reakčného produktu v mieste antigénu. Vzorku je potom možné sfarbiť kontrastným farbivom a zakryť krycím sklíčkom. Výsledky sa vyhodnocujú pomocou svetelného mikroskopu. Kontrolné sklíčka obsahujú tri vo formáline fixované a v parafíne zaliate ľudské bunkové línie rakoviny prsníka s výsledkom intenzity farbenia 0, 1+ a 3+ a sú k dispozícii pre overenie cyklov farbenia. Intenzita farbenia týchto línií buniek bola v súlade s počtom receptorov na jednu bunku. HercepTest, Kód K5207, je použiteľný pre automatizované farbenie využívajúce farbiaci automat Autostainer. ( ) P04455SK_01_K / str. 25/50

26 Rakovina žalúdka Činidlá - žalúdok Dodané materiály Nižšie uvedené materiály sú dostatočné pre 50 testov (50 sklíčok inkubovaných s primárnou protilátkou k proteínu HER2 a 50 sklíčok inkubovaných príslušným činidlom pre negatívnu kontrolu). Počet testov je založený na použití 200 µl na jeden tkanivový rez (22 mm x 22 mm) z fľaštičiek č. 1, 2, 3 a 4 a roztoku substrát-chromogén (DAB). Súprava poskytuje dostatočný materiál pre max. 15 jednotlivých cyklov farbenia. Fľaštička č. Množstvo 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L Popis Peroxidase-Blocking Reagent: 3 % peroxid vodíka s obsahom 15 mmol/l azidu sodného (NaN 3 ). Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Afinitne izolovaná protilátka, pripravená na použitie. Dodáva sa v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, ktorý obsahuje stabilizujúci proteín. Imunogén: Syntetický C-koncový fragment (intracytoplazmická časť) proteínu HER2, spojený s kľúčovou dierkou limpet hemocyanínu. Špecifičnosť: Proteín HER2. Purifikačná metóda: Protilátka je afinitne izolovaná pomocou imobilizovaného peptidu proteínu HER2. Visualization Reagent: Dextranový polymér konjugovaný s chrenovou peroxidázou a afinitne izolovanými kozími antizajačími imunoglobulínmi. Dodáva sa v Tris-HCl pufri, ktorý obsahuje stabilizujúci proteín a antimikrobiálne činidlo. Negative Control Reagent: Imunoglobulínová frakcia normálneho zajačieho séra pri ekvivalentnej koncentrácii proteínu ako v protilátke na proteín HER2. Dodáva sa v 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, ktorý obsahuje stabilizujúci proteín. DAB Buffered Substrate: Substrátový pufrovaný roztok, ph 7,5, ktorý obsahuje < 0,1 % peroxidu vodíka, stabilizátory, posilovače a antimikrobiálny prostriedok. DAB Chromogen: 5 % chromogénový roztok 3,3'- diaminobenzidinu tetrahydrochloridu. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citrátový pufer s obsahom detergentu. Wash Buffer (10x): Tris/HCl pufer s detergentom a antimikrobiálnym prostriedkom. ( ) P04455SK_01_K / str. 26/50

27 3 x 5 sklíčok Rakovina žalúdka Control Slides: Každé sklíčko obsahuje časti troch formalínom fixovaných v parafíne zaliatych bunkových línií rakoviny prsníka, ktoré predstavujú rôzne úrovne vylučovania proteínu HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) a SK-BR-3 (3+). Kontrolné sklíčka boli tepelne spracované pre lepšiu adherenciu rezov k podložným sklíčkam. Akékoľvek ďalšie tepelné ošetrenie kontrolných sklíčok z dôvodu zlepšenia adherencie rezov k podložným sklíčkam môže ovplyvniť výsledky farbenia. POZNÁMKA: Všetky činidlá, vrátane vyhľadávacieho roztoku epitopu a premývacieho puferu sú pripravené špeciálne pre použitie s týmto testom. Pre správne prevedenie testu by ste nemali použiť náhrady s výnimkou premývacieho pufru, kde sa môže použiť roztok Dako, Kód S3006. Potrebný materiál, ktorý sa nedodáva Hydroxid amónny, 15 mol/l zriedený na 37 mmol/l Kontrastné farbivo: Hematoxylin, ako napr. Mayer's Hematoxylin na báze vody, Dako kód č. Kód S3301 (viď NÁVOD NA POUŽITIE, A.4) Krycie sklíčka Destilovaná nebo deionizovaná voda (voda k premývaniu) Sušička, schopná udržiavať teplotu najviac 60 C Etanol, neriedený a 95 % Svetelný mikroskop (zväčšenie objektívu 4 40x) Montážne médium, ako napr. Dako Faramount, Kód S3025, alebo Glycergel, Kód C0563 Pozitívne a negatívne tkanivá pre kontroly procesu (viď časť Kontrola kvality) Podložné sklá SuperFrost Plus, potiahnuté poly-l-lysínom alebo Dako Silanized Slides, Kód S3003 (viď Príprava vzoriek) Nádoby alebo kúpele pre farbenie Časovač (umožňujúci intervaly 2 40 minút) Vodný kúpeľ s krytom (schopný udržovať roztok na vyhľadávanie epitopu pri teplote C) Xylen, toluén alebo substitúty xylénu K5207 bol prispôsobený na použitie s Autostainer Immunostaining System, Kód S3400. Prosím prečítajte si užívateľskú príručku pre farbiaci automat, kde nájdete potrebné komponenty pre farbiaci automat. Skladovanie - žalúdok Skladujte pri teplote 2 8 C. Túto súpravu nepoužívajte po uplynutí dátumu, vytlačeného na vonkajšej strane obalu. Ak sa činidlá skladujú za akýchkoľvek iných než v príbalovom letáku uvedených podmienok, musí užívateľ tieto podmienky overiť (14a, 14b). Kontrolné sklíčka sa musia skladovať pri teplote 2 8 C. Neexistujú známky nestability tohto výrobku. Preto je nutné prevádzať pozitívne a negatívne kontroly súčasne so vzorkou pacienta. Ak spozorujete neočakávané zafarbenie, ktoré nie je možné vysvetliť zmenami laboratórnych postupov a máte podozrenie, že sa jedná o problém s HercepTest, obráťte sa na technické služby spoločnosti Dako. ( ) P04455SK_01_K / str. 27/50

28 Rakovina žalúdka Príprava vzoriek - žalúdok S adenokarcinómnymi vzorkami žalúdka vrátane gastroezofageálneho spojenia v dôsledku biopsie, excízie a resekcie je nevyhnutné zaobchádzať správne z dôvodu zachovania imunocytochemického zafarbenia. U všetkých vzoriek by sa mali používať štandardné spôsoby spracovania tkaniva (15). Ak sa testujú malé vzorky biopsie zaistite pre hodnotenie IHC intaktnú morfológiu nádoru a prítomnosť dostatočného množstva nádorových buniek. Ak sa vykonáva analýza HercepTest na vzorkách biopsie, je potrebné analyzovať vzorky biopsie z viacerých (7 8) vyhodnotiteľných vzoriek z rôznych regiónov nádoru, aby sa zabezpečila spoľahlivá determinácia stavu HER2. Rezy zaliate v parafíne Tkanivá uchovávané v neutrálnom pufrovanom formalíne zaliatie v parafíne sú vhodné pre spracovanie. Vzorky tkaniva by mali byť narezané do blokov o hrúbke približne 3 alebo 4 mm a fixované hodín v neutrálnom pufrovanom formalíne. Vzorky z biopsie boli fixované na dobu 6 8 hodín v štúdii ToGA (referencia k štúdii pozri (37)). Tkanivá sú potom dehydratované v sérii alkoholov a xylénov, nasledované infiltráciou rozpusteným parafínom, udržiavaným do teploty 60 C. Správne zafixované a zalia te tkanivá, vylučujúce proteín HER2 vydržia pred rezaním a umiestnením na podložné sklo neurčitú dobu, pokiaľ sa skladujú na chladnom mieste (15 25 C) (15, 16). V USA, norma Cl inical Laboratory Improvement Act z roku 1988 požaduje v 42 CFR (b), aby Laboratórium udržovalo zafarbené sklíčka minimálne desať rokov od dátumu skúšky a udržiavalo bloky vzoriek najmenej dva roky od dátumu skúšok (16). Vzorky tkaniva je nutné narezať na rezy o hrúbke 4 5 µm, namontovať na sklíčka a prirodzene usušiť pri izbovej teplote na minimálne 12 hodín (alebo až do ich uschnutia) alebo pri 37 C cez noc alebo pri 60 C po dobu jednej hodiny. UPOZORNENIE: Nadmerné zahrievanie po dobu viac ako jedna hodina pri 60 C môže viesť k výraznej strate špecifickej membránovej imunoreaktivity spojenej s HER2 (17). Pre uchovanie antigenicity sa musia rezy tkaniva, uložené na sklíčku (SuperFrost Plus, Poly-Llysine alebo silanizované sklíčka) zafarbiť do 4 6 týždňov od narezania, ak sú uchovávané pri izbovej teplote (20 25 C) (18). Sklíčka, požadované pre vyhodnotenie proteínu HER2 a overenie prítomnosti nádoru by mali byť pripravené v rovnakom čase. Odporúča sa najmenej 5 sklíčok, 1 sklíčko pre prítomnosť nádoru, 2 sklíčka pre vyhodnotenie proteínu HER2 (1 pre inkubáciu s fľaštičkou č. 2 a 1 pre inkubáciu s fľaštičkou č. 4) a 2 sklíčka ako záloha. Používanie testu HercepTest TM na delkacifikovaných vzorkách nebolo overené a neodporúča sa. Prečítajte si dokumentáciu od spoločnosti Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) a referenčné odkazy 15 a 16, kde nájdete ďalšie podrobné informácie o príprave vzoriek. Spracovanie tkanív pred farbením Pre získanie optimálnej účinnosti testu sa musí využiť špecifická metóda získavania epitopu, varenie v 10 mmol/l citrátovom pufri. Roztok vyhľadávania epitopu je súčasťou sady HercepTest. Táto metóda vyžaduje zahriatie časti vzorky, uložených na sklíčkach a ponorených v 10 mmol/l citrátovom pufri (20) v kalibrovanom vodnom kúpeli, ktorý je schopný udržať roztok na odkrytie epitopu na požadovanej teplote (95 99 C). Laboratóriá, sídliace vo vyšších nadmorských výškach musia stanoviť najlepšiu metódu k udržiavaniu potrebnej teploty vodného kúpeľa. Vyhľadávanie cieľa musí prebiehať vo vodnom kúpeli. Iné metódy zahrievania boli testované, ale neposkytli reprodukovateľné výsledky. Bezprostredne po ukončení vyhľadávania epitopu začnite proces farbenia. Odchýlky od opísaného postupu môžu viesť k nesprávnym výsledkom. ( ) P04455SK_01_K / str. 28/50

29 Bezpečnostné opatrenia - žalúdok 1. Určené na diagnostické použitie in vitro. 2. Určené pre odborníkov. Rakovina žalúdka 3. Fľaštička 1, činidlo blokujúci peroxidázu, obsahuje 3 % peroxidu vodíka. Bezpečnostný list pre profesionálnych užívateľov je k dispozícii na požiadanie. 4. Fľaštička 6, DAB chromogén, obsahuje 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride a má označenie: Nebezpečenstvo H350 Môže spôsobiť rakovinu. H341 Podozrenie, že spôsobuje genetické poškodenie. P201 Pred použitím sa oboznámte s osobitnými pokynmi. P280 Noste ochranné rukavice. Noste ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Noste ochranný odev. P308 + P313 V PRÍPADE expozície alebo podozrenia z nej: Vyhľadajte lekársku pomoc/starostlivosť. P405 Uchovávajte uzamknuté. P501 Zneškodnite obsah a nádobu v súlade s miestnymi, regionálnymi, celoštátnymi a medzinárodnými predpismi. Základné pravidlo osoby mladšie ako 18 rokov nesmú s týmto produktom pracovať. Užívatelia musia byť riadne preškolení čo sa týka správneho pracovného postupu, nebezpečných vlastností produktu a nutných bezpečnostných opatrení. Ďalšie informácie nájdete v Bezpečnostnom liste o materiáloch (SDS). 5. Fľaštička 8, premývací pufer, obsahuje 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3- diol hydrochloride a 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. Môže spôsobiť alergickú reakciu. Wash Buffer (10x) má označenie: H319 P280 Pozor P264 P305 + P351 + P338 Spôsobuje vážne podráždenie očí. Noste ochranné rukavice. Noste ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Noste ochranný odev. Po manipulácii si starostlivo umyte ruky. PO ZASIAHNUTÍ OČÍ: Niekoľko minút ich opatrne vyplachujte vodou. Ak používate kontaktné šošovky a ak je to možné, odstráňte ich. Pokračujte vo vyplachovaní. 6. Tento výrobok obsahuje azid sodný (NaN 3 ), ktorý je v čistej forme vysoko toxický. Aj keď koncentrácia azidu sodného vo výrobku nie je klasifikovaná ako nebezpečná, azid sodný môže reagovať s olovom a meďou v odpadovom potrubí a vytvárať vysoko výbušné azidy ťažkých kovov. Pri likvidácii splachujte dostatočným množstvom vody, aby nedochádzalo k usadzovaniu azidov kovov v potrubí (21, 22). 7. Fľaštička 2, 3 a 4 obsahuje materiály živočíšneho pôvodu. Rovnako ako pri každom výrobku biologického pôvodu je nevyhnutné dodržiavať správne postupy pri manipulácii. 8. S kontrolnými sklíčkami pred a po fixácii a so všetkými ostatnými materiálmi, ktoré s nimi príjdu do styku, je nutné manipulovať ako s potenciálne infekčným materiálom a je nutné ich likvidovať v súlade s riadnymi bezpečnostnými opatreniami (23). Nikdy nenaberajte činidlá do pipety ústami a zamedzte kontaktu činidel a vzoriek s kožou a sliznicami. Ak sa činidlá dostanú do kontaktu s citlivými oblasťami, umyte ich dostatočným množstvom vody. ( ) P04455SK_01_K / str. 29/50

30 Rakovina žalúdka 9. Minimalizujte mikrobiálnu kontamináciu činidel, aby nevzniklo nešpecifické zafarbenie. 10. Nedodržanie inkubačnej doby, teploty alebo metódy môže viesť k chybným výsledkom. Nadmerné sušenie po dobu viac ako jedna hodina pri 60 C môže viesť k výraznej strate špecifickej membránovej imunoreaktivity spojenej s HER2 (17). 11. Činidlá sú optimálne nariedené. Ďalšie zriedenie môže viesť k strate antigénového zafarbenia. 12. Všetky činidlá, vrátane vyhľadávacieho roztoku epitopu a premývacieho puferu sú pripravené špeciálne pre použitie s týmto testom. Pre správne prevedenie testu by ste nemali použiť náhrady s výnimkou premývacieho pufru, kde sa môže použiť roztok, Kód S Vizualizačné činidlo a chromogén DAB môžu byť v prípade vystavenia pôsobeniu intenzívneho svetla negatívne ovplyvnené. Neskladujte zložky systému ani neprevádzajte farbenie pri silnom svetle, napríklad pri priamom slnečnom svetle. 14. Používajte osobné ochranné prostriedky, aby nedošlo k zasiahnutiu očí alebo pokožky. Ďalšie informácie nájdete v Bezpečnostnom liste o materiáloch (SDS). 15. Parafínové zvyšky môžu viesť k falošne negatívnym výsledkom. 16. Z dôvodov presnej interpretácie výsledkov testu HercepTest počas zafarbenia vzoriek z biopsie v dôsledku adenokarcinómu žalúdka vrátane gastroezofageálneho spojenia sa odporúča prítomnosť zhluku minimálne 5 zafarbených nádorových buniek. Zhluk najmenej 5 zafarbených nádorových buniek pozostáva z 5 spojených HER2 zafarbených nádorových buniek. 17. Aby sa dosiahli spoľahlivé výsledky je dôležité vykonať testovanie HER2 IHC na viacerých vzorkách (7 8) biopsie z rôznych regiónov nádoru z dôvodu heterogénnej povahy vzoriek biopsie rakoviny žalúdka. 18. Použitie iných ako odporúčaných objemov činidiel môže viesť k strate viditeľnosti imunologickej reakcie HER2. Rezy tkaniva väčšie než 22 mm x 22 mm budú vyžadovať 2 3 kvapky v objeme 200 µl činidla na 2 3 miesta automatickej aplikácie. 19. V prípade, ak vzorka vykazuje vysokú úroveň heterogenity, sa odporúča testovať viac ako jeden blok tkaniva resekcie žalúdočnej rakoviny (41). NÁVOD NA POUŽITIE - žalúdok A. Príprava činidla Je vhodné pripraviť pred farbením nasledujúce činidlá: A.1 Vyhľadávací roztok epitopu Rozrieďte pred započatím plánovaného farbiaceho postupu dostatočné množstvo roztoku, fľaštička 7 (vyhľadávací roztok epitopu x 10)1:10 pomocou destilovanej alebo deionizovanej vody. Nepoužitý nariedený roztok môžete skladovať počas jedného mesiaca pri teplote 2 8 C. Rozriedený roztok zlikvidujte, ak je zakalený. A.2 Premývací pufer Rozrieďte dostatočné množstvo roztoku fľaštičky 8 (premývací pufer x 10) 1:10 pomocou destilovanej alebo deionizovanej vody pre premývacie kroky. Nepoužitý nariedený pufer môžete skladovať jeden mesiac pri teplote 2 8 C. Pufer zlikvidujte, a k je zakalený. Farbiaci automat je naprogramovaný tak, že opláchne tkanivové rezy po činidle blokujúcom peroxidázou a roztokom so substrátovým chromogénom. Upozorňujeme, že na tieto kroky premývania sa môže použiť destilovaná (alebo deionizovaná) voda alebo premývací pufer. Všetky ostatné premývacie kroky si vyžadujú použitie premývacieho puferu. A.3 Roztok substrát-chromogén (DAB) Pridaním 11 kvapiek (25 30 µl na kvapku) chromogénu DAB z fľaštičky 6 do jednej fľaštičky 5 obsahujúcej pufrovaný substrát DAB (11 ml) a premiešaním pripravíte roztok substrát- ( ) P04455SK_01_K / str. 30/50

31 Rakovina žalúdka chromogén. Hotový roztok substrát-chromogén (DAB) je stabilný po dobu približne 5 dní, ak je skladovaný pri 2 8 C. Roztok treba pred použitím riadne premiešať. Prípadná prítomnosť zrazeniny v roztoku neovplyvní kvalitu farbenia. POZNÁMKA: Farba DAB chromogénu vo fľaštičke 6 sa môže líšiť od čírej až po svetlohnedú levandulovú. To však funkciu tohto produktu neovplyvní. Riediť v súladu s postupom uvedeným v príbalovom letáku. Pridanie príliš veľkého množstva DAB chromogénu do DAB substrátového puferu spôsobí poškodenie pozitívneho signálu. A.4 Kontrastné farbivo Zafarbený výsledný produkt farbiacej reakcie DAB nie je rozpustný v alkohole ani vo vode. Použite hematoxylínové kontrastné farbivo a nastavte jeho intenzitu farbenia na podobnú úroveň, ako je znázornená v Dako Pokyny pre interpretáciu testu HercepTest rakovina žalúdka. Môže sa použiť hematoxylín, buď na alkoholovej alebo vodnej báze, ako napr. Dako Mayer's Hematoxylin, Kód S3301. Po hematoxylínovom kontrastnom farbení starostlivo opláchnite v destilovanej alebo deionizovanej vode, potom ponorte sklíčka s tkanivami do kúpeľa 37 mmol/l vodného roztoku amoniaku (viď časť B.2, krok 3). Vodný roztok amoniaku (37 mmol/l) sa pripravuje zmiešaním 2,5 ml 15 mol/l (koncentrovaného) hydroxidu amónneho s 1 litrom destilovanej alebo deionizovanej vody. Nevyužitý vodný roztok amoniaku 37 mmol/l môžete skladovať pri izbovej teplote (20 25 C) v utesnenej fľaši až 12 mesiacov. A.5 Montážne médium Odporúčame použiť permanentné upevňovacie médium bez obsahu vody. Vodná montáž je však tiež prípustná. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Kód S3025, alebo Glycergel Mounting Medium, Kód C0563, sa doporučuje pre vodnú montáž. Glycergel pred použitím skvapalnite zahrievaním na približne 40 (±5) C. B. Metódy farbenia vykonávané vo farbiacom automate Autostainer B.1 Poznámky k postupu Užívateľ by si mal tieto pokyny pozorne prečítať a pred použitím sa zoznámiť so všetkými súčasťami a prístrojovým vybavením (viď Bezpečnostné opatrenia). Všetky činidlá by mali byť pred imunologickým farbením zahriate na izbovú teplotu (20 25 C). Podobne aj všetky inkubácie by mali prebi ehať pri izbovej teplote. Nedovoľte, aby tkanivové rezy uschli počas zakladania do farbiaceho automatu a počas procesu farbenia. Suché rezy tkanív môžu vykazovať zvýšenie nešpecifického zafarbenia. Ak sa musí proces farbenia prerušiť, sklíčka treba odložiť do puferového kúpeľa po inkubácii primárnej protilátky na dobu do jednej hodiny pri izbovej teplote (20 25 C) bez ovplyvnenia účinnosti farbenia. Odstránenie parafínu a rehydratácia: Pred farbením musia byť sklíčka s tkanivami zbavené parafínu, aby sa odstránilo médium, v ktorom je tkanivo zaliate a aby sa mohlo rehydrovať. Zaistite úplné odstránenie parafínu. Prítomnosť zvyškov zalievacieho média spôsobí zvýšené nešpecifické zafarbenie. Tento krok by sa mal prevádzať pri izbovej teplote (20 25 C). 1. Vložte sklíčka do xylenového kúpeľa a inkubujte počas 5 (±1) minút. Vymeňte kúpeľ a znovu zopakujte postup. 2. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do neriedeného etanolu na 3 (±1) minúty. Vymeňte kúpeľ a znovu zopakujte postup. 3. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do 95 % etanolu na 3 (±1) minúty. Vymeňte kúpeľ a znovu zopakujte postup. 4. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do destilovanej alebo deionizovanej vody na minimálne 30 sekúnd. Začnite postup farbenia, ako je popísané v časti B.2, krok 1, vyhľadávanie epitopu. ( ) P04455SK_01_K / str. 31/50

32 Rakovina žalúdka Roztoky xylénu a alkoholu je nutné vymeniť po 40 sklíčkach. Namiesto xylénu môžete použiť toluén alebo substitúty xylénu, napríklad Histoclear. POZNÁMKA: Činidlá a návody dodané v tejto súprave boli navrhnuté pre optimálnu účinnosť. Ďalšie riedenie činidiel alebo zmena inkubačných teplôt môže viesť k nesprávnym alebo nesúhlasným výsledkom. Rozdiely v spracovaní tkanív a v technických postupoch v laboratóriu užívateľa môžu znehodnotiť výsledky štúdie pre použitie u vybraných pacientov na terapiu Herceptin. ( ) P04455SK_01_K / str. 32/50

33 B.2 Protokol farbenia Prevedené pri izbovej teplote, C. Rakovina žalúdka Krok 1: Vyhľadávanie epitopu Naplňte farbiace nádoby, napr. nádoby Coplin nariedeným roztokom vyhľadávania epitopu (viď NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.1). Vložte farbiace nádoby obsahujúce roztok vyhľadávania epitopu do vodného kúpeľa. Zahrejte vodný kúpeľ a roztok vyhľadávania epitopu na C. Ohrievaním sa vzhľad roztoku na odkrytie epitopu stáva zakaleným. Prikryte nádoby viečkom, aby sa stabilizovala teplota a aby nedochádzalo k odparovaniu. Ponorte rezy, z ktorých bol odstránený parafín pri izbovej teplote do predhriateho roztoku vyhľadávania epitopu v nádobách na farbenie. ZMEŇTE TEPLOTU VODNÉHO KÚPEĽA A ROZTOKU PRE VYHĽADÁVANIE EPITOPU SPÄŤ NA C. Inkubujte 40 (±1) minút pri teplote C. Vyberte celú nádobu so sklíčkami z vodného kúpeľa. Nechajte sklíčka vychladnúť v roztoku na vyhľadávanie epitopu počas 20 (±1) minút pri izbovej teplote. Zlejte roztok na vyhľadávanie epitopu a opláchnite rezy v premývacom puferi (viď NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2). Pre docielenie lepšieho výsledku máčajte rezy v premývacom puferi počas 5 20 minút po vyhľadávaní epitopu a pred farbením. POZNÁMKA: Roztok vyhľadávania epitopu je určený len pre jednu aplikáciu. Nepoužívajte opakovane. Krok 2: Postup pre farbiaci automat 1. Použite farbiacim automatom vygenerovaný plán autoprogramu HercepTest pre požadované časy programu a objemy činidiel (pozri bod 4 ohľadne špecifických objemov). 2. Vložte fľaštičky s činidlami do stojanu na činidlá v automate podľa plánu pre činidlá vygenrovaného počítačom. 3. Vložte podložné sklá do farbiaceho automatu podľa plánu podložných skiel vygenerovaného počítačom. 4. Nastavte program a spustite program HercepTest. Nasleduje nákres programového cyklu: Opláchnuť 200 µl činidla blokujúceho peroxidázu - 5 minút Opláchnuť 200 µl primárneho anti-her2 proteínu (alebo činidlo negatívnej kontroly) - 30 minút Opláchnuť 200 µl vizualizačné činidlo - 30 minút Opláchnuť Opláchnuť Prepnúť 200 µl substrát-chromogenového roztoku (DAB) - 10 minút Po kroku so substrát-chromogénom opláchnite sklá v deionizovanej vode POZNÁMKA: Farbiaci automat hardvérovej verzie 01 preplachuje sklá v pufri. Z tohto dôvodu je treba sklá po vybratí z automatu prepláchnuť v deionizovanej vode. Krok 3: Kontrastné farbenie (návod pre hematoxylín) Vyberte podložné sklá z farbiaceho automatu a zafarbite ich v hematoxylíne ako je popísané nižšie. Ponorte sklíčka do hematoxylínového kúpeľa. Inkubujte 2 5 minút, v závislosti od koncentrácie použitého hematoxylínu. Opatrne opláchnite vo vodnom kúpeli reagenčnej kvality. Uistite sa, že ste odstránili všetok zostávajúci hematoxylín. ( ) P04455SK_01_K / str. 33/50

34 Rakovina žalúdka Voliteľné: Ponorte sklíčka 10krát do kúpeľa 37 mmol/l vodného roztoku amoniaku (viď časť A.4). Opláchnite opatrne sklíčka v kúpeli s destilovanou alebo deionizovanou vodou na 2 5 minút. POZNÁMKA: V závislosti na inkubačnej dobe a potencii použitého hematoxylínu spôsobí kontrastné farbenie bledomodré až tmavomodré zafarbenie bunkových jadier. Prílišné alebo neúplné kontrastné zafarbenie môže ohroziť správnu interpretáciu výsledkov. Krok 4: Montáž Odporúčame použiť permanentné upevňovacie médium bez obsahu vody. Vodná montáž je však tiež prípustná. Vzorky môžu byť namontované a prekryté montážnym médiom na báze vody, napríklad Dako Faramount, Kód S3025 alebo Glycergel, Kód C0563. POZNÁMKA: Sklíčka je možné čítať kedykoľvek je to vhodné. Pokiaľ sú sklíčka počas viac než jedného týždňa prekryté vodným montážnym médiom a vystavené intenzívnemu svetlu, môže dôjsť k určitému vyblednutiu. Z dôvodu minimalizácie vyblednutia skladujte sklíčka v tme a pri izbovej teplote (20 25 C). Kontrola kvality - žalúdok Rozdiely vo fixácii tkanív, spracovaní a zaliatí tkanív v laboratóriu užívateľa môžu spôsobiť výraznú variabilitu výsledkov, ktorá si vyžiada pravidelné prevádzanie vlastných kontrol v spojitosti s kontrolnými sklíčkami, dodávanými Dako. V USA pre ďalšie informácie konzultujte pokyny pre kontrolu kvality certifikačného programu College of American Pathologists (CAP) pre imunohistochémiu, viď tiež CLSI (skôr NCCLS) Quality Assurance pre imunocytochémiu, schválené smernice (24) a referencie 25. Tabuľka 8. Účel dennej kontroly kvality. Tkanivo: Fixované a spracované ako vzorka pacienta Špecifická protilátka a sekundárna protilátka Nešpecifická protilátka* alebo pufer plus rovnaká sekundárna protilátka ako tá, ktorá bola použitá so špecifickou protilátkou Pozitívna kontrola: Tkanivo alebo bunky obsahujúce cieľový antigén, ktorý sa má nájsť (môže sa nachádzať v pacientovom tkanive). Ideálna kontrola je slabo pozitívne zafarbené tkanivo, lebo toto je najcitlivejšie na degradáciu protilátky alebo antigénu. Kontroluje všetky kroky analýzy. Overuje činidlo a postupy použité pre farbenie proteínu HER2 Zistenie nešpecifického farbenia pozadia Negatívna kontrola: Tkanivá a bunky, u ktorých sa očakáva, že budú negatívne (môžu sa nachádzať v pacientovom tkanive alebo pozitívnom kontrolnom tkanive) Zistenie neplánovanej krížovej reaktivity s bunkami/s časťami buniek Zistenie nešpecifického farbenia pozadia Tkanivo pacienta Zistenie špecifického farbenia Zistenie nešpecifického farbenia pozadia Kontrolné sklíčko dodávané Dako Kontroluje iba proces farbenia * Sérum z rovnakých druhov ako špecifická protilátka, avšak nezamerané proti rovnakému cieľovému antigénu. Pre zaznamenanie nešpecifických viazaní protilátok, napr. viazanie Fc časti protilátky tkanivom. Kontrolné sklíčko (dodané): Každé z dodaných kontrolných sklíčok obsahuje tri obalené, formalínom fixované, v parafíne zaliate línie buniek ľudskej rakoviny prsníka s výsledkami intenzity farbenia 0, 1+ a 3+. V každom cykle farbenia by sa malo farbiť jedno sklíčko. Vyhodnotenie bunečných línii na podložných sklíčkach s kontrolnými vzorkami dodaných firmou Dako rozhoduje o platnosti cyklu farbenia. Tkanivo pre pozitívnu kontrolu: Kontrolné vzorky by mali byť čerstvo fixované vzorky z pitvy/biopsie/operácie, spracované a zaliate čo najskôr rovnakým spôsobom ako vzorka (vzorky) pacienta. Pozitívne kontroly tkanív sú známkou správne pripravených tkanív a použitia ( ) P04455SK_01_K / str. 34/50

35 Rakovina žalúdka správnych metód farbenia. Pre každú sadu testovacích podmienok by mala byť v každom cykle farbenia prevedená jedna pozitívna kontrola tkaniva. U tkanív použitých pre pozitívnu kontrolu by sa malo prejaviť mierne zafarbenie, aby mohli tkanivá zaznamenať mierne zmeny v citlivosti primárnej protilátky. Kontrolné sklíčka dodané so súpravou alebo vzorky, vytvorené odlišne od vzorky (vzoriek) pacienta overujú len účinnosť činidla a neoverujú prípravu tkaniva. Na ideálnu pozitívnu kontrolu tkaniva použite predtým určený proteín HER2 2+ nadmieru vylučujúci tkanivo adenokarcinómu žalúdka vrátane gastroezofageálneho spojenia. POZNÁMKA: Známe tkanivá pre pozitívnu kontrolu sa môžu použiť na monitorovanie správneho prevedenia spracovaných tkanív a test činidiel, NIE ako pomoc pri formulácii špecifickej diagnózy vzoriek pacienta. Ak tkanivá pozitívnej kontroly zlyhajú pri preukázaní príslušného pozitívneho sfarbenia, výsledky so vzorkami pacienta by sa mali považovať za neplatné. Tkanivo pre negatívnu kontrolu: Pri každom farbiacom cykle používajte fixované tkanivo pre negatívnu kontrolu (o ktorej vieme, že je proteín HER2 negatívny), spracovanou a zaliatou identickým spôsobom ako vzorka (vzorky) pacienta, aby bola overená špecificita primárnej protilátky a aby sa prejavilo špecifické zafarbenie pozadia. Hrubé črevo, pečeň alebo štítna žľaza sú vhodné pre tkanivo negatívnej kontroly. Rozmanitosť rôznych typov buniek, ktoré sa nachádzajú vo väčšine rezov tkaniva, ponúka vnútorné oblasti pre negatívnu kontrolu (to by mal overiť užívateľ). Ak sa špecifické zafarbenie vyskytne v tkanive pre negatívnu kontrolu, výsledky so vzorkou pacienta treba považovať za neplatné a test treba opakovať. Nešpecifické činidlo negatívnej kontroly: Použite dodané činidlo pre negatívnu kontrolu namiesto primárnej protilátky s rezom každej vzorky pacienta a vyhodnoťte tak nešpecifické zafarbenia a umožnite lepšiu interpretáciu špecifického zafarbenia v oblasti antigénu. Inkubačná doba činidla pre negatívnu kontrolu by mala zodpovedať inkubačnej dobe primárnej protilátky. Overenie testu: Pred prvým použitím protilátky alebo farbiaceho systému v diagnostickej metóde by mal užívateľ overiť špecificitu protilátky tak, že ju vyskúša u niekoľkých sérií v laboratóriu dostupných tkanív so známou imunocytochemickou charakteristikou účinnosti, ktoré predstavujú známe pozitívne a negatívne tkanivá. Zoznámte sa s postupmi pre kontrolu kvality, popísanej v tejto časti príbalového letáku a s požiadavkami pre kontrolu kvality na báze certifikačného programu CAP pre imunohistochémiu alebo CLSI (skôr NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (Schválená smernice CLSI pre zaisťovanie kvality pre imunohistochémiu), (24). Tieto postupy kontroly kvality je treba zopakovať pre každú novú šaržu protilátok, alebo keď nastane zmena v parametroch testu. Na overenie testu sú vhodné adenokarcinómy žalúdka vrátane gastroezofageálneho spojenia so známymi intenzitami zafarbenia proteínu HER2 od 0 3+ a negatívne tkanivá, napr. hrubé črevo, pečeň alebo štítna žľaza. ( ) P04455SK_01_K / str. 35/50

36 Rakovina žalúdka Interpretácia farbenia - žalúdok Pre determináciu nadmerného vylučovania proteínu HER2 by sa mali vyhodnocovať len membránová intenzita zafarbenia a vzor pomocou rozsahu, uvedeného v tabuľke 9. Sklíčka by mal vyhodnocovať patológ pomocou svetelného mikroskopu. Pre vyhodnotenie imunohistochemického zafarbenia a výsledku je vhodný objektív s 10x zväčšením. Použitie objektívu so zväčšením 5 40x je vhodný pre potvrdenie výsledku. Cytoplazmické zafarbenie treba považovať za nešpecifické zafarbenie a nezahŕňa sa do vyhodnotenia intenzity membránového zafarbenia (8). Pre pomoc v diferenciácii zafarbenia 0, 1+, 2+, a 3+ sa obráťte na Dako Pokyny pre interpretáciu testu HercepTest rakovina žalúdka, kde nájdete reprezentatívne obrázky intenzít zafarbenia a vzorov. Započítať sa môžu len vzorky od pacientov s adenokarcinómom žalúdka vrátane gastroezofageálneho spojenia. V prípadoch intestinálnych metaplázií a adenokarcinómu žalúdka v tej istej vzorke sa započítajú len zložky adenokarcinómu žalúdka. Na správnu interpretáciu výsledkov získaných pomocou testu HercepTest sa odporúča hodnotiť zhluk minimálne 5 zafarbených nádorových buniek. Zhluk najmenej 5 zafarbených nádorových buniek pozostáva z 5 spojených HER2 zafarbených nádorových buniek. Tabuľka 9. Interpretácia a vyhodnotenie imunohistochemického zafarbenia HER2 Výsledok Vzorky z oparácie vzor zafarbenia Vzorky z biopsie vzor zafarbenia Hodnotenie nadmernej tvorby proteínu HER2 0 V < 10 % nádorových buniek nebola pozorovaná zafarbenie alebo membránove zafarbenie Nebolo pozorované zafarbenie alebo (alebo 5 < zhlukoch) membránové zafarbenie Negatívny 1+ Nepatrné/slabo rozoznateľné membránové zafarbenie bolo zaznamenané 10 % nádorových buniek; bunky boli reaktívne lev v časti membrány Zhluk nádorových buniek ( 5 buniek) s nepatrným/slabo rozoznateľným membránovým zafarbením bez ohľadu na percento zafarbených buniek Negatívny 2+ Slabo až stredne rozoznateľné celkové, bazolaterálne alebo laterálne membránové zafarbenie v 10 % nádorových buniek Zhluk nádorových buniek ( 5 buniek) so slabým až stredne rozoznateľným celkovým, bazolaterálnym alebo laterálnym membránovým zafarbením bez ohľadu na percento zafarbených buniek Nejasný 3+ Silne rozoznateľné celkové, bazolaterálne alebo laterálne membránové zafarbenie v 10 % nádorových buniek Zhluk nádorových buniek ( 5 buniek) so silne rozoznateľným celkovým, bazolaterálnym alebo laterálnym membránovým zafarbením bez ohľadu na percento zafarbených buniek Pozitívny Pokyny založené na metódach Hofmanna et al. (40). HercepTest sa interpretuje ako negatívny pre nadmerné vylučovanie proteínu HER2 (0 a 1+ intenzita farbenia), nejasný (2+ intenzita farbenia) a pozitívny (3+ intenzita farbenia). HercepTest nie je určený pre poskytovanie prognostických informácií pacientovi a lekárovi a nebol na tento účel overený. Pre každý cyklus farbenia by mali byť sklíčka skontrolované podľa inštrukcií, uvedených v tabuľke 10, aby sa určila platnosť cyklu sfarbovania a umožnilo semikvantitatívne vyhodnotenie intenzity zafarbenia vzorky tkaniva. ( ) P04455SK_01_K / str. 36/50

37 Rakovina žalúdka Tabuľka 10. Inštrukcie pre vyhodnotenie sklíčka. Inštrukcie pre čítanie sklíčka Odôvodnenie 1. Kontrolné sklíčko, obsahujúce tri línie buniek Prítomnosť 3+ hnedého zafarbenia membrány bunky (lemovanie) v 3+ kontrolnej línii bunky SK-BR-3, čiastočne hnedé lemovanie v 1+ kontrolnej línii bunky MDA-175, a zafarbenie 0 v kontrolnej línii bunky MDA-231 indikuje platný test Bodové a nesúvislé zafarbenie membrány je prítomné v malom až v strednom počte buniek v slabo pozitívnej 1+ kontrolnej línii bunky MDA-175. Tiež akoby bodové imunozafarbenie Golgi oblasti cytoplazmy je možné pozorovať v tejto línii buniek. Prítomnosť hnedého zafarbenia v 0 kontrolnej línii buniek MDA- 231 (negatívne pre zafarbenie proteínu HER2) indikuje, že sa počas testu nevyskytlo nešpecifické zafarbenie. Výsledky testu môžu byť neplatné kvôli nadmernému zafarbeniu. 2. Sklíčka tkaniva pre pozitívnu kontrolu Je možné pozorovať prítomnosť hnedého zafarbenia membrány. Zafarbenie cytoplazmy a negatívnych tkanív nesmie byť viac ako Sklíčka tkaniva pre negatívnu kontrolu ABSENCIA alebo špecifické zafarbenie v sklíčkach pre negatívnu kontrolu tkaniva potvrdzujú nedostatok krížovej reaktivity súpravy k bunkám/bunkovým prvkom. Ak sa špecifické membránové zafarbenie vyskytne v sklíčkach pre negatívnu kontrolu tkaniva, výsledky so vzorkou pacienta treba považovať za neplatné. 4. Sklíčka tkaniva pacienta, zafarbené pomocou činidla negatívnej kontroly 5. Sklíčka tkaniva pacienta, zafarbené pomocou primárnej protilátky Absencia špecifického zafarbenia membrány potvrdzuje špecifické označovanie cieľového antigénu primárnou protilátkou Iné žltohnedé alebo hnedé zafarbenie, vyskytujúce sa v cytoplazme vzorky, spracovanej činidlom negatívnej kontroly, ako je spojivové tkanivo, leukocyty, erytrocyty alebo nekrotické tkanivo treba považovať za nešpecificky zafarbené pozadie a treba ho oznámiť v odseku pre komentáre údajového listu. Ak sa vo vzorke zistí nadmerné vylučovanie proteínu HER2, objaví sa ako hnedé lemovanie na membráne nádorových buniek, ošetrených primárnou protilátkou 1. Kontrolné sklíčko (dodané): Kontrolné sklíčko, zafarbené pomocou HercepTest treba najprv preskúmať, či všetky činidlá správne fungujú. Prítomnosť hnedého (3,3 - diaminobenzidín, DAB) produktu reakcie v membráne bunky indikuje pozitívnu reaktivitu. Prítomnosť obvodového hnedého zafarbenia membrány bunky (lemovanie) v 3+ kontrolnej línii bunky SK-BR-3, čiastočne hnedé lemovanie v 1+ kontrolnej línii bunky MDA-175 a zafarbenie v 0 kontrolnej línii bunky MDA-231 indikuje platný test. Ak nejaká z kontrolných línií bunky je mimo týchto kritérií, všetky výsledky so vzorkou pacienta treba považovať za neplatné. 2. Tkanivo pre pozitívnu kontrolu: Sklíčko tkaniva pre pozitívnu kontrolu treba preskúmať ako nasledujúce. Toto sklíčko potvrdzuje, že fixačná metóda a spôsob vyhľadania epitopu sú efektívne. Používajte neporušené bunky pre interpretáciu výsledkov zafarbenia, pretože nekrotické alebo degenerované bunky sa často zafarbia nešpecificky (26). Zafarbenie musí byť pozorované v nádorovom tkanive ako hnedé zafarbenie membrány bunky. Hnedé zafarbenie cytoplazmy a negatívne tkanivá v rámci vzorky nesmú vykazovať intenzitu sfarbenia viac ako Tkanivo pre negatívnu kontrolu: Sklíčko tkaniva pre negatívnu kontrolu sa musia vyšetriť po tkanivách pre pozitívnu kontrolu, aby sa overila špecifičnosť označenia cieľového antigénu primárnou protilátkou. Absencia špecifického zafarbenia v tkanive pre negatívnu kontrolu potvrdzuje nedostatok krížovej reaktivity súpravy k bunkám/bunkovým prvkom. Ak sa špecifické membránové zafarbenie vyskytne v tkanive pre negatívnu kontrolu, výsledky so vzorkou pacienta treba považovať za neplatné. Alternatívne, negatívne časti tkaniva pre pozitívnu kontrolu môžu slúžiť ako tkanivo pre negatívnu kontrolu, ale to musí overiť užívateľ. Zapamätajte si, že slabá reakcia (0 1+ intenzita zafarbenia) sa dá pozorovať u väčšiny normálneho epitelového tkaniva. Možné tkanivá pre negatívnu kontrolu zahŕňajú: hrubé črevo, pečeň a štítnu žľazu. Nešpecifické zafarbenie, ak sa vyskytne, bude mať difúzny vzhľad. Sporadické zafarbenie spojivového tkaniva sa dá tiež pozorovať v rezoch z tkanív, nadmerne fixovaných formalínom. ( ) P04455SK_01_K / str. 37/50

38 Rakovina žalúdka Tkanivo pacienta: Nakoniec preskúmajte vzorky pacienta, zafarbené pomocou HercepTest. Pozitívnu intenzitu zafarbenia treba vyhodnocovať v kontexte každého nešpecifického zafarbenia pozadia činidla negatívnej kontroly. Ako pri každom imunocytochemickom teste znamená negatívny výsledok, že antigén nebol zaznamenaný, nie že antigén nie je prítomný v testovaných bunkách/tkanive. Viď časti Súhrn a vysvetlenie, Obmedzenia a Charakteristiky účinnosti pre špecifické informácie ohľadne imunoreaktivity testu HercepTest. Ďalšie odporúčania pre interpretáciu zafarbenia HercepTest Adenokarcinóm žalúdka vrátane gastroezofageálneho spojenia testovaného na nadmerné vylučovanie proteínu HER2 sa hodnotia v škále od 0 do 3+. Keďže prípady 0 a 3+ sú čisté rezy, malé percento zo zvyšných vzoriek 1+ a 2+ sa dá ťažšie interpretovať. Používajte nasledujúce smernice pre interpretáciu zafarbenia testu HercepTest vo vašom laboratóriu. Vyhodnoťte línie buniek pre overenie účinnosti testu. Vyhodnoťte sklíčka pre pozitívnu a negatívnu kontrolu. Hematoxylínové a eozínové (H&E) zafarbenie vzoriek tkaniva sa doporučuje pre prvé vyhodnotenie. (Nádor nemôže byť viditeľný pri pohľade na vzorku, zafarbenú pomocou HercepTest. Pre overenie prítomnosti nádoru patológom sa vyžaduje H&E zafarbené sklíčko.). HercepTest TM musí byť prevedený na párovanom rezu (sériové rezy) z rovnakého parafínového bloku vzorky. Najprv vyhodnoťte zafarbené rezy na nadmerné vylučovanie proteínu HER2 pri nízkej intenzite. Väčšina pozitívnych prípadov bude zreteľná pri slabom zväčšení. U prípadov s výsledkom 1+ použite k overeniu membránového zafarbenia zväčšení 40x. U prípadov s výsledkom 2+ použite k overeniu membránového zafarbenia zväčšení 10x 20x. Vzorky z operácie Dobre zachovalé a dobre zafarbené oblasti vzorky treba použiť na určenie percenta pozitívnych buniek nádoru. Ak väčšina buniek nádoru vykazuje úplné bazolaterálne alebo laterálne zafarbenie membrány, zafarbenie je buď 2+ alebo 3+. Ak je kompletné bazolaterálne alebo laterálne zafarbenie membrány silnej intenzity u viac ako alebo rovno 10 % nádorových buniek z operácie, výsledok vzorky je 3+. Ak je kompletné bazolaterálne alebo laterálne zafarbenie membrány slabej alebo strednej intenzity u viac ako alebo rovno 10 % nádorových buniek z operácie, výsledok vzorky je 2+. Ak je viac ako 10 % nádorových buniek vo vzorkách z operácie zafarbené iba v časti membrány, s nejasnou / sotva znateľnou intenzitou, je skóre vzorku 1+. Ak má menej ako 10 % nádorových buniek vo vzorkách z operácie kompletné bazolaterálne alebo laterálne zafarbenie membrány alebo má zafarbenú časť svojej membrány, je skóre vzorku 0. Ak nebolo pozorované zafarbenie, je skóre chirurgických vzoriek 0. Vzorky z biopsie Zhluk najmenej 5 zafarbených nádorových buniek pozostáva z 5 spojených HER2 zafarbených nádorových buniek. Ak je prítomný zhluk najmenej 5 zafarbených nádorových buniek so silne rozoznateľným celkovým, bazolaterálnym alebo laterálnym membránovým zafarbením, skóre vzorku z biopsie je 3+, bez ohľadu na percento zafarbených buniek. ( ) P04455SK_01_K / str. 38/50

39 Rakovina žalúdka Ak je prítomný zhluk najmenej 5 zafarbených nádorových buniek so slabo až stredne rozoznateľným celkovým, bazolaterálnym alebo laterálnym membránovým zafarbením, skóre vzorku z biopsie je 2+, bez ohľadu na percento zafarbených buniek. Ak je prítomný zhluk najmenej 5 zafarbených nádorových buniek s nepatrným/slabo rozoznateľným celkovým, bazolaterálnym alebo laterálnym membránovým zafarbením, skóre vzorku z biopsie je 1+, bez ohľadu na percento zafarbených buniek. Ak nebolo pozorované zafarbenie, je skóre vzoriek biopsie 0. Ak je pozorované zafarbenie membrány (bez ohľadu na intenzitu zafarbenia) v menej ako 5 nádorových bunkách, skóre vzorky z biopsie je 0. Obmedzenia - žalúdok Všeobecné obmedzenia 1. Imunocytochémia je diagnostický proces, ktorý si vyžaduje špecializované vyškolenie vo výbere vhodných činidiel, výbere tkanív, fixácii a spracovaní; príprave imunocytochemického sklíčka a interpretácii výsledkov zafarbenia. 2. Zafarbenie tkaniva závisí od manipulácie s tkanivom a od jeho spracovania pred farbením. Nesprávna fixácia, zmrazenie, rozmrazenie, umývanie, sušenie, zahrievanie, rezanie alebo kontaminácia inými tkanivami alebo tekutinami môže viesť k vzniku artefaktov, zachyteniu protilátky alebo nesprávnym negatívnym výsledkom. Výsledky môžu byť nekonzistentné v dôsledku použitia rôznych metód fixácie a zaliatia alebo v dôsledku vnútorných nepravidelností v tkanive. 3. Prílišné alebo neúplné kontrastné zafarbenie môže ohroziť správnu interpretáciu výsledkov. 4. Klinická interpretácia ktoréhokoľvek pozitívneho zafarbenia alebo jeho absencie sa musí vyhodnotiť v kontexte klinickej prezentácie, morfológie a iných histopatologických kritérií. Klinická interpretácia ktoréhokoľvek zafarbenia alebo jeho absencie musí byť doplnená morfologickou štúdiou a správnymi kontrolami, ako sú iné diagnostické testy. Je zodpovednosťou kvalifikovaného patológa, oboznámeného z protilátkami, činidlami a používanými metódami, interpretovať zafarbenú vzorku. Zafarbenie sa musí prevádzať v certifikovanom, licencovanom laboratóriu pod dozorom patológa, zodpovedného za vyhodnotenie zafarbených sklíčok a za určenie primeranosti pozitívnej a negatívnej kontroly. 5. Tkanivá osôb, nakazených vírusom hepatitídy B a obsahujúce povrchový antigen hepatitídy B (HBsAg) môžu vykazovať nešpecifické zafarbenie s chrenovou peroxidázou (27). Činidlá môžu vykázať nečakané reakcie v predtým netestovaných typoch tkaniva. Možnosť nečakaných reakcií ani v testovaných typoch tkaniva nemôže byť úplne eliminovaná kvôli biologickej variabilite vylučovania antigénu v novotvaroch alebo iných patologických tkanivách (28). So zdokumentovanou nečakanou reakciou sa obráťte na technický servis spoločnosti Dako. 6. Nesprávne pozitívne výsledky sa môžu vyskytovať v dôsledku neimunologickej väzby proteínov alebo produktov reakcie so substrátom. Môžu byť tiež spôsobené aktivitou pseudoperoxidázy (erytrocyty) a endogénnou aktivitou peroxidázy (cytochrom C) (28). 7. Proces zafarbovania treba prevádzať pri teplote okolia C. Špecifické obmedzenia pre tento výrobok 1. Antigén, prítomný v 1+ kontrolnej línii buniek MDA-175 sa časom znehodnocuje. Vyhodnotenie výsledkov kontrolného sklíčka v spojení s dátumom expirácie kontrolného sklíčka. Negatívne zafarbenie buniek MDA-175 môže znamenať iba to, že kontrolné sklíčko bolo znehodnotené. Kontrolné sklíčka sa musia skladovať pri teplote 2 8 C. 2. Nesprávne negatívne výsledky môžu byť spôsobené časovým znehodnotením antigénu v tkanivách. Vzorky sa musia zafarbiť počas 4 6 týždňov od montáže tkaniva na sklíčka, ak boli skladované pri izbovej teplote (20 25 C) (29). ( ) P04455SK_01_K / str. 39/50

40 Rakovina žalúdka 3. Pre optimálne reprodukovateľné výsledky, proteín HER2 vyžaduje vyhľadávanie tepelne indukovaným vyhľadávaním epitopu, ak sú tkanivá bežne zafixované (neutrálne puferovaný formalín) a zaliate v parafíne. Toto predbežné spracovanie treba vykonať na začiatku celého procesu zafarbenia. Inštrukcie viď časť Príprava vzoriek, Spracovanie tkanív pred farbením. 4. Teplom navodené vyhľadávanie epitopu proteínu HER2 sa musí používať len s kalibrovaným vodným kúpeľom. Iné metódy zahrievania boli testované, ale neposkytli reprodukovateľné výsledky. 5. Nenahrádzajte činidlá súpravy činidlami s inými číslami kódov alebo činidlami od iných výrobcov. Jedinou výnimkou je premývací pufer, ktorý môžete nahradiť pufrom Dako Wash Buffer, Kód S Nesprávne výsledky môžete získať vyhodnotením cytoplazmického zafarbenia. Pri interpretácii výsledkov berte do úvahy len intenzitu zafarbenia membrány buniek. 7. Zafarbené kontrolné sklíčka sa musia použiť len na vyhodnotenie cyklu zafarbenia a nesmú sa použiť ako doplnok výsledku reakcie zafarbenia v rezoch tkaniva. 8. Silné fokálne zafarbenie (3+), napr. horúce body, sa môžu príležitostne objaviť. Môže to byť výsledkom nerovnej fixácie alebo spracovania tkaniva. Odporúča sa imunologické zafarbenie druhého bloku tkaniva tej istej vzorky. 9. Použitie HercepTest na vzorkách fixovaných v iných fixatívoch ako neutrálne puferovaný formalín nebolo overené. 10. Zapamätajte si, že normálna tonzila a ezofageálny epitel sa môže zafarbiť až do intenzity Mali by ste sa vyhnúť používaniu poškodených vzoriek tkaniva z rakoviny žalúdka a interpretácii zafarbenia v dôsledku artefaktov na bioptickom okraji. Charakteristiky účinnosti - žalúdok Pozadie Bezpečnosť a účinnosť trastuzumabu (Herceptin TM ) bola preukázaná v klinickej štúdii (ToGA test) (38, 39). Táto štúdia bola navrhnutá ako otvorená, randomizovaná, multicentrická štúdia s III fázami u HER2-pozitívnych pacientov s neoperovateľným a lokálne rozšíreným rekurentným a/alebo metastatickým adenokarcinómom žalúdka alebo gastroezofageálneho spojenia. Pre test ToGA bola definovaná pozitívnosť HER2 ako buď IHC-pozitívny (3+) (HercepTest, Dako) a/alebo pozitívny pomocou HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (súprava HER2 FISH pharmdx, Dako). Po začlenení do štúdie boli pacienti randomizovaní do skupín liečby chemoterápiou (5-FU alebo capecitabin a cisplatin) alebo chemoterápiou plus trastuzumabom. Hlavným hľadiskom úspešnosti liečby bola celkovou dobou prežitia (overall survival, OS). V tejto štúdii bolo celkovo randomizovaných 594 pacientov a 584 pacientov dostávalo skúmaný liek a následne boli zaradení do súboru kompletnej analýzy (FAS). Z hľadiska hlavného cieľu štúdie bola kombinovaná liečba chemoterapie a trastuzumabu štatisticky významne lepšia ako liečba samotnou chemoterapiou. Medián OS sa zvýšil z 11,1 mesiacov na 13,8 mesiacov (p=0,0046) s mierou rizika 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Krívky Kaplan-Meiera pre OS sú zobrazené na obrázku 1. ( ) P04455SK_01_K / str. 40/50

41 Rakovina žalúdka Pravdepodobnosť prežitia 1,0 0,9 0,8 0,7 Log-rank test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Čas (mesiace) Č. vľavo Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Liečebná skupina Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Obrázok 1. Krívka Kaplan-Meiera pre OS (n=584). Analýza predbežne špecifikovanej prieskumnej podskupiny v súvislosti so stavom HER2 bola vykonaná pri dostupnosti údajov. Neskôr boli definované dve podskupiny HER2 v rámci určovania IHC škály: Skupina 1 (skupina s nízkym vylučovaním HER2): Skupina 2 (skupina s vysokým vylučovaním HER2): IHC 0/FISH+ a IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ a IHC 3+ vrátanie IHC 3+ (FISH+ alebo FISH- alebo FISH žiaden výsledok (n=446) Po opakovaniu primárnych analýz OS u skupiny s vysokým vylučovaním HER2 (n=446) bol prínos kombinovanej liečby dokonca vyšší. Medián OS vo skupine pacientov liečených kombináciou chemoterapie a trastuzumabu sa zvýšil na 16 mesiacov v porovnaniu k 11,8 mesiacom u pacientov liečených samotnou chemoterapiou. Miera rizika sa v tejto analýze znížila na 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Krivky Kaplan-Meiera prežitia OS pre skupinu s vysokým vylučovaním HER2 je zobrazená na obrázku 2. ( ) P04455SK_01_K / str. 41/50

42 Rakovina žalúdka Pravdepodobnosť prežitia 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Čas (mesiace) Č. vľavo Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Liečebná skupina Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Obrázok 2. Krivka Kaplan-Meiera prežitia OS pre skupinu s vysokým vylučovaním HER2 (n=446). Test ToGA preukázal, že kombinácia testovania IHC a FISH je prediktívna pre účinok kombinovanej liečby chemoterapie a trastuzumabu, avšak zdá sa, že diagnostické analýzy ukazujú, že pacienti s nadmernou expresiou proteínu HER2 (IHC2+/FISH+ and IHC3+) vyťažia zo samotnej terapie viac. To je možné vysvetľovať faktom, že proteín je cieľom liečby trastuzumabom. Ďalší informácie o testu ToGA nájdete v príbalovom letáku pre Herceptin TM. Reprodukovateľnosť Reprodukovateľnosť vo vnútri cyklu: Reprodukovateľnosť vo vnútri cyklu bola testovaná v laboratóriu s 3 vzorkami o rôznej intenzite IHC výsledku zafarbenia. Každá vzorka prebiehala v trojnásobnom cykle. Tento protokol bol použitý pri automatickom farbení. Všetky vzorky udávali 100 % reprodukovateľné výsledky. Reprodukovateľnosť vo vnútri cyklu bola testovaná v laboratóriu s 11 vzorkami o rôznej intenzite IHC výsledku zafarbenia. Každá vzorka prebiehala v trojnásobnom cykle. Tento protokol bol použitý s manuálnym zafarbením. Všetky vzorky udávali 100 % reprodukovateľné výsledky. Reprodukovateľnosť medzi cyklami a medzi laboratóriami: Analýza testu HercepTest so 60 rôznymi vzorkami rakoviny žalúdka získanými z oblastí žalúdka alebo gastroezofageálneho spojenia predstavujúce resekcie a biopsie, ktoré boli vykonané počas piatich nie po sebe idúcich dňoch a v troch rôznych laboratóriách. Všetkých 60 vzoriek štúdie bolo rovnomerne rozložených do troch stavových kategórií HER2. Šiesti patológovia vypočítali celkové 2040 skóre HER2. Úroveň zhody na dennej báze (negatívna, sporná, pozitívna) bola v rozpätí od 83,1 % do 98,3 %. V 47 zo 60 možných porovnaní sa dosiahla zhoda 90,0 % a vyššie. V špecifických prípadoch porovnania na dennej báze sa preukázala zhoda 91,2 %, 92,5 % a 92,5% pre všetky tri laboratóriá, pozri tabuľku 11. Zhoda medzi jednotlivými laboratóriami bola 82,7 %, 75,0 % a 88.0%, v príslušnom poradí medzi každým párom laboratórií (pozri tabuľku 12). Podľa Fisherovho testu presnosti neboli výsledky medzi jednotlivými laboratóriami rozdielne. Zhoda medzi jednotlivými pozorovateľmi z radov patológov v každom laboratóriu bola pre všetky tri laboratóriá 88,0 %, 83,6 % a 81,0 %, v uvedenom poradí (tabuľku 13). ( ) P04455SK_01_K / str. 42/50

43 Rakovina žalúdka V záverečnej analýze testu HercepTest vzoriek rakoviny žalúdka v troch laboratóriách preukázali dobrú úroveň zhody medzi jednotlivými pozorovaniami, pokiaľ ide o dni, laboratóriá a pozorovateľov. Tabuľka 11. Celková zhoda na dennej báze vyjadrená v percentách podskupina 12 zo 60 porovnaní Laboratórium 1 Laboratórium 2 Laboratórium 3 1 CI95 LL: 95% dolný limit intervalu spoľahlivosti. Pozorovateľ 1 Pozorovateľ 2 Priemerná Zhoda CI95 LL 1 Zhoda CI95 LL 1 zhoda Deň 1 verzus Deň 2 85,0 74,4 93,3 84,9 Deň 3 verzus Deň 4 93,3 84,9 93,3 84,9 Deň 1 verzus Deň 2 95,0 87,3 83,1 72,0 Deň 3 verzus Deň 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Deň 1 verzus Deň 2 90,0 80,5 91,7 82,7 Deň 3 verzus Deň 4 96,7 89,7 91,7 82,7 Tabuľka 12. Celková zhoda medzi jednotlivými laboratóriami vyjadrená v percentách 91,2 92,5 92,5 Zhoda CI95 LL 1 Priemerná zhoda Deň 1 verzus Laboratórium 2 Deň 1 verzus Laboratórium 3 Deň 2 verzus Laboratórium 3 Deň 1 verzus Deň 1 83,3 72,4 Deň 2 verzus Deň 2 85,0 74,4 Deň 3 verzus Deň 3 85,0 74,4 Deň 4 verzus Deň 4 81,7 70,5 Deň 5 verzus Deň 5 78,3 66,7 Deň 1 verzus Deň 1 80,0 68,6 Deň 2 verzus Deň 2 73,3 61,2 Deň 3 verzus Deň 3 78,3 66,7 Deň 4 verzus Deň 4 68,3 55,9 Deň 5 verzus Deň 5 75,0 63,0 Deň 1 verzus Deň 1 88,3 78,5 Deň 2 verzus Deň 2 86,7 76,4 Deň 3 verzus Deň 3 90,0 80,5 Deň 4 verzus Deň 4 86,7 76,4 Deň 5 verzus Deň 5 88,3 78,5 1 CI95 LL: 95% dolný limit intervalu spoľahlivosti. 82,7 75,0 88,0 ( ) P04455SK_01_K / str. 43/50

44 Rakovina žalúdka Tabuľka 13. Zhoda medzi jednotlivými pozorovateľmi vyjadrená v percentách Zhoda CI 95 LL 1 Priemerná zhoda Laboratórium 1 Laboratórium 2 Laboratórium 3 Deň 1 91,7 82,7 Deň 2 91,7 82,7 Deň 3 93,3 84,9 Deň 4 83,3 72,4 Deň 5 80,0 68,6 Deň 1 86,4 76,0 Deň 2 83,3 72,4 Deň 3 83,3 72,4 Deň 4 83,3 72,4 Deň 5 81,7 70,5 Deň 1 80,0 68,6 Deň 2 78,3 66,7 Deň 3 80,0 68,6 Deň 4 78,3 66,7 Deň 5 90,0 80,5 1 CI95 LL: 95% dolný limit intervalu spoľahlivosti. 88,0 83,6 81,0 Imunoreaktivita Tabuľka 14 sumarizuje HercepTest imunoreaktivitu s doporučeným panelom normálnych tkanív. Všetky tkanivá boli fixované formalínom a zaliate parafínom a zafarbené pomocou HercepTest podľa pokynov v príbalovom letáku. Tabuľka 14. Súhrn reaktivity HercepTest normálneho tkaniva Typ tkaniva (počet testovaných) Nadoblička (3) Kostná dreň (3) Mozog/Cerebellum (3) Mozog/Cerebellum (3) Prsia (3) Krčok maternice (3) Hrubé črevo (3) Ezofág (3) Srdce (3) Oblička (3) Pečeň (3) Pľúca (3) Mezoteliálne bunky (3) Vaječníky (3) Pankreas (3) Paratyroid (3) Periférne nervy (3) Hypofýza (3) Prostata (3) Slinná žľaza (3) Kostrové svalstvo (3) Pokožka (3) Tenké črevo (3) Slezina (3) Žalúdok (3) Semenníky Týmus (3) Štítna žľaza (3) Tonzila (3) Maternica (3) Pozitívny prvok zafarbenia tkaniva a vzor zafarbenia Mliečna žľaza (2 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, < 5 % buniek) Epitelové bunky (1 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, < 5 % buniek, membránové a cytoplazmatické, zrnité) Folikulárne epitelové bunky (1 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, < 5 % buniek, membránové a cytoplazmatické) Skvamózny epitel (1 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, < 5 % buniek. 2 z 3 tkanív, 2+ intenzita zafarbenia, % buniek. Membránové a cytoplazmatické) Endometriálne tkanino (2 z 3 tkanív, 1+ intenzita zafarbenia, % buniek, cytoplazmatické, zrnité) U všetkých tkanív sa zisťovalo zafarbenie membrány, ak nie je uvedené inak. Všetky tri vzorky každého typu tkaniva mali rovnakú intenzitu zafarbenia, pokiaľ nie je uvedené inak. ( ) P04455SK_01_K / str. 44/50

45 Rakovina žalúdka Riešenie problémov - žalúdok Informácie o ďalších riešeniach problémov nájdete v už spomenutej príručke Dako (19) alebo kontaktujte oddelenie technického servisu Dako pre oznámenie nezvyčajného zafarbenia. Problém Pravdepodobná príčina Odporúčaný postup 1. Nedochádza k farbeniu sklíčok. 1a. Chyba programovania. Činidlá nie sú použité v správnom poradí. 1a. Skontrolujte programovú kartičku, aby ste overili, či bol proces farbenia naprogramovaný správne 2. Sklíčka sú slabo zafarbené. 1b. Fľaštičky s činidlami neboli správne založené do stojanu na činidlá 1c. Nedostatok činidla vo fľaštičke 1d. Azid sodný v premývacom roztoku 1e. Nadmerné zahrievanie namontovaných rezov tkaniva pred odstránením parafínu a pred tepelne indukovaným vyhľadávaním epitopu môže viesť k strate viditeľnosti imunoreaktivity HER2. 2a. Neprimerané vyhľadávanie epitopu 2b. Neprimerané inkubačné doby činidla 2c. Bol použitý nevhodný spôsob fixácie 2d. Nadmerné zahrievanie namontovaných rezov tkaniva pred odstránením parafínu a pred tepelne indukovaným vyhľadávaním epitopu môže viesť k výraznému zníženiu viditeľnosti imunoreaktivity HER2. 2e. Bol aplikovaný nedostatočný objem činidla 1b. Skontrolujte plán pre činidlá, aby ste overili správne umiestnenie fľaštičiek 1c. Zabezpečte, aby bolo dosť činidla v fľaštičke pred začatím procesu. Prečítajte si plán činidiel ohľadne potrebného objemu 1d. Použite čerstvo pripravený premývací pufer, ktorý je súčasťou sady 1e. Tkanivové rezy nechajte buď prirodzene usušiť pri izbovej teplote na minimálne 12 hodín alebo až do ich uschnutia. Prípadne ich môžete sušiť pri 37 C cez noc alebo pri 60 C po dobu maximálne jednej hodiny. Sušenie rezov tkaniva pri vyšších teplotách je možné vykonávať len v kalibrovanej sušiarni s rovnomernou distribúciou tepla (17). 2a. Skontrolujte, či roztok pre vyhľadávanie epitopu bol zahrievaný na C po celú dobu 40 minút a či chladol po dobu ďalších 20 minút 2b. Prezrite si pokyny pre postup zafarbenia 2c. Skontrolujte, či nie je tkanivo pacienta príliš fixované a či je použitý schválený fixačný prostriedok 2d. Tkanivové rezy nechajte buď prirodzene usušiť pri izbovej teplote na minimálne 12 hodín alebo až do ich uschnutia. Prípadne ich môžete sušiť pri 37 C cez noc alebo pri 60 C po dobu maximálne jednej hodiny. Sušenie rezov tkaniva pri vyšších teplotách je možné vykonávať len v kalibrovanej sušiarni s rovnomernou distribúciou tepla (17). 2e. Skontrolujte veľkosť tkanivového rezu (22 mm x 22 mm) a objem ( ) P04455SK_01_K / str. 45/50

46 3. Prílišné zafarbenie pozadia sklíčok. 3a. Parafín nie je odstránený úplne 3b. Pri montáži rezov na sklíčka sa použili škrobové prísady 3c. Sklíčka nie sú dôkladne opláchnuté 3d. Pri postupe farbení došlo k vysušeniu rezov 3e. Rezy vyschli pri nakladaní do farbiaceho automatu 3f. Bol použitý nevhodný spôsob fixácie Rakovina žalúdka aplikovaného činidla 3a. Používajte čerstvé čisté roztoky, postupujte podľa návodu uvedeného v časti B.1 3b. Pre lepenie rezov na sklíčka nepoužívajte prísady. Mnohé prísady sú imunoreaktívne 3c. Zabezpečte, aby bol farbiaci automat správne naplnený pred chodom. Skontrolujte, či je dosť pufru pre celý cyklus. Používajte čerstvé roztoky pufrov a premývacích roztokov 3d. Skontrolujte, či bol použitý primeraný objem činidla na podložné sklá. Skontrolujte, či farbiaci automat pracuje s vrchnákom v zatvorenej polohe a či nie je vystavený nadmernému teplu alebo prievanu 3e. Zabezpečte, aby zostali rezy v pufri počas nakladania a pred začatím chodu 3f. Skontrolujte, či bolo použité doporučené fixatívum. Iné fixatíva môžu zapríčiniť prílišné zafarbenie pozadia 4. Tkanivo sa oddeľuje od sklíčok 5. Príliš silné špecifické zafarbenie 3g. Nešpecifická väzba činidiel k tkanivu 3g. Skontrolujte, či je vzorka dobre fixovaná alebo či sa u nej nevyskytuje nekróza 4a. Použitie nesprávnych sklíčok 4a. Používajte silanizované sklíčka, napríklad silanizované sklíčka Dako Silanized Slides, Kód S3003, SuperFrost Plus alebo poly-llysínom potiahnuté sklíčka 5a. Bol použitý nevhodný spôsob fixácie 5b. Použitie nesprávneho tepelného zdroja vyhľadávania epitopu, napr. vyvíjač pary, mikrovlnná rúra alebo autokláv 5c. Inkubačné doby činidla sú príliš dlhé 5d. Bol použitý nevhodný premývací roztok 5a. Dohliadnite, aby boli použité len schválené spôsoby fixácie. 5b. Dohliadnite, aby bol použitý vodný kúpeľ pre vyhľadávanie epitopu 5c. Prezrite si pokyny pre postup zafarbenia 5d. Používajte len premývací roztok doporučený pre použitie s touto súpravou. ( ) P04455SK_01_K / str. 46/50

47 6. Slabé zafarbenie 1+ kontrolného sklíčka línie buniek 7. Roztok na odkrytie epitopu je zakalený pri zohrievaní 8. Roztok na odkrytie epitopu je zakalený počas skladovania (pred zohrievaním) 6a. Postupovalo sa podľa nesprávneho protokolu vyhľadávania epitopu 6b. Nedostatok reakcie s roztokom substrát-chromogén (DAB) 6c. Znehodnotenie kontrolného sklíčka 7. Pri zahrievaní sa roztok stáva zakaleným 8. Roztok nebol správne skladovaný alebo uplynul dátum exspirácie roztoku Rakovina žalúdka 6a. Ponorte sklíčko do predhriateho roztoku na vyhľadávanie epitopu. Uveďte teplotu roztoku pre vyhľadávanie epitopu späť na C a predbežne spracovávajte celých 40 minút 6b. Zaistite, že sa využilo plných 10 minút inkubačnej doby. Zaistite, že len jedna kvapka DAB chromogénu bola pridaná k 1 ml puferovaného substrátu DAB 6c. Skontrolujte dátum expirácie a skladovacie podmienky súpravy na vonkajšej strane obalu 7. Ide o normálny jav, ktorý nemá žiadny vplyv na zafarbenie 8. Skontrolujte dátum exspirácie a skladovacie podmienky súpravy na vonkajšej strane obalu. Zlikvidujte roztok na odkrytie epitopu POZNÁMKA: Ak nie je možné za príčinu problému považovať žiadnu z uvedených príčin alebo pokiaľ sa nepodarí problém vyriešiť doporučeným postupom, obráťte sa so žiadosťou o pomoc na Dako technickú podporu. Ďalšie informácie o technikách farbenia a prípravy vzoriek môžete nájsť v predtým spomínanej príručke Dako (19) (dostupná u Dako), Atlas imunohistológie (30) a techniky imunoperoxidázy. Praktický prístup k diagnostike nádorov (31). ( ) P04455SK_01_K / str. 47/50

48 Literatúra 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985;229: Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986;319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45: Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990;2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an anti-p185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003. b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, DakoCytomation California Inc., Data on file. 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4: "Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides", Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD, "Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts." Center for Disease Control Manual Guide: Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA, April 30, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; ( ) P04455SK_01_K / str. 48/50

49 25. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78: Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, a kol. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04455SK_01_K / str. 49/50

50 Vysvetlivky k symbolom Katalógové číslo Teplotné obmedzenie Číslo šarže Piktogram GHS (prečítajte si časť o preventívnych opatreniach) Lekársky nástroj na diagnostiku in vitro Manipulovať opatrne kr ehké Použiť do Piktogram GHS (prečítajte si časť o preventívnych opatreniach) Pozri návod na použitie Obsah postačuje na <n> testov Výrobca Vyrobené: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dánsko Tel Fax V USA distribuuje: Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tel. 805/ Bezplatne: 800/ Informácie pre objednávanie Tel. 800/ Fax 805/ Technický servis: Tel. 800/ HercepTest a Herceptin sú ochranné známky spoločnosti Genentech, Inc., predmet licencie vlastní Dako Denmark A/S a F. Hoffmann-La Roche Ltd. ( ) P04455SK_01_K / str. 50/50