cobas EGFR Mutation Test

Transcription

1 cobas EGFR Mutation Test URČENÉ NA DIAGNOSTICKÉ POUŽITIE IN VITRO. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 Tests P/N: OZNÁMENIE: Nákupom tohto produktu kupujúci získava právo na využitie tohto produktu na amplifikáciu a detekciu sekvencií nukleových kyselín pomocou reakcie reťazca polymerázy (PCR) a na súvisiace procesy v oblasti ľudskej diagnostiky in vitro. Okrem vyššie uvedeného zvláštneho práva na používanie nevyplýva z vyššie uvedeného nárok na žiadny všeobecný patent, ani žiadny iný typ licencie. ÚČEL POUŽITIA cobas EGFR Mutation Test je test PCR v reálnom čase na kvalitatívnu detekciu a identifikáciu mutácie v exonoch 18, 19, 20 a 21 génu receptora epidermálneho rastového faktora (EGFR) v DNA derivovanej z ľudského formaldehydom fixovaného parafínom zaliateho tkaniva nemalobunkového pľúcneho karcinómu (NSCLC). Test je určený na použitie na identifikáciu pacientov s pokročilým NSCLC, ktorých nádory obsahujú mutácie exonov 18, 19, 20 a 21 génu EGFR a výber pacientov na liečbu malomolekulovými inhibítormi tyrozín kinázy (TKI), cielenými na EGFR. Vzorky sa spracúvajú pomocou súpravy na prípravu vzoriek DNA cobas a pomocou analyzátora cobas z 480, ktorý slúži na automatizovanú amplifikáciu a detekciu. SÚHRNNÉ INFORMÁCIE A VYSVETLENIE TESTU Aktivačné mutácie v kódovaní génu EGFR sa vyskytujú predovšetkým u NSCLC a majú za následok konštitutívnu aktiváciu aktivity kinázy proteínu EGFR a prispieva tak k onkogénnemu procesu. 1 Prevalencia týchto mutácií pri nevybraných prípadoch NSCLC je približne 10 %. Tieto mutácie sa však najčastejšie vyskytujú, nie však výhradne, u pacientok nefajčiarok a ľahkých fajčiarok s ázijskými predkami s histológiami adenokarcinómu. 2 Klinické údaje naznačujú, že u pacientov s pokročilým štádiom nádorov NSCLC sa vyskytujú aktivačné mutácie EGFR, ktoré sa najčastejšie vyskytujú ako delécie v exone 19, alebo ako bodové mutácie L858R v exone 21, vykazujú vysokú mieru odpovede a dlhodobého prežitia bez progresie (PFS, progression-free survival) pri liečbe TKI anti-egfr TKI, a to v prvej i v druhej línii liečby. 3-5 Responzívnosť na anti-egfr terapie umožňuje predvídať aj ďalšie menej časté mutácie EGFR, ako sú substitúcie G719X v exone 18 a bodová mutácia L861Q v exone Medián prežitia u pacientov s NSCLC s mutantovým EGFR liečených anti-egfr TKI je v súčasnosti približne 2 roky. 9 Súčasné klinické pravidlá odporúčajú zvážiť liečbu anti-egfr TKI v prvej línii liečby pri pokročilom NSCLC s mutantom EGFR. 10,11 U väčšiny pacientov s NSCLC s mutantovým EGFR sa pri liečbe anti-egfr TKI nakoniec vyvinie progresívne ochorenie. Približne v polovici týchto progresívnych prípadov možno identifikovať vznik mutácií sekundárnej rezistencie v géne EGFR, najčastejšie mutácie T790M v exone U niektorých pacientov môžu byť tieto mutácie sekundárnej rezistencie zistené v nádoroch pred liečbou anti-egfr TKI. Hoci tieto neliečené prípady TKI stále vykazujú vysokú úroveň odpovede na liečbu, u týchto pacientov sa zdá, že majú výrazne kratšie PFS než pacienti, nádory ktorých nemajú tieto sekundárne mutácie. 6,13 PRINCÍPY PROCEDÚRY cobas EGFR Mutation Test je založený na dvoch hlavných procesoch: (1) ručnej príprave vzorky na získanie genomickej DNA z FFPET a (2) amplifikácie a detekcie PCR cieľovej DNA použitím doplnkových párov primerov a oligonukleotidových vzoriek značených fluorescenčnými farbivami. Test je určený na detekciu G719X (G719A, G719C a G719S) v exone 18, delécií a komplexných mutácií v exone 19, S768I, T790M a vložení v exone 20, a L858R v exone 21. Detekcia mutácií sa dosahuje pomocou analýzy PCR analyzátorom cobas z 480. Súčasťou každého cyklu je kontrolná vzorka mutantu a negatívna kontrolná vzorka na potvrdenie validity cyklu. Príprava vzorky Vzorky FFPET sa spracovávajú a genomické DNA sa izolujú pomocou súpravy na prípravu vzoriek DNA cobas, všeobecným manuálnym postupom prípravy vzorky na báze väzby kyseliny nukleovej na sklenené vlákna. Deparafinizovaná 5 µm sekcia vzorky FFPET sa rozkladá inkubáciou pri zvýšenej teplote a obsahu proteázy a chaotropického dezintegračného/väzbového roztoku, ktorý uvoľňuje nukleové kyseliny a chráni uvoľnenú genomickú DNA proti DNázam. Následne sa do dezintegračnej zmesi pridá izopropanol a dezintegračná zmes sa odstreďuje v stĺpci s vložkou zo skleneného vlákna. Počas odstreďovania sa genomická DNA naviaže na povrch filtra zo sklenených vlákien. Nenaviazané látky, akými sú napríklad soli, proteíny a iné bunkové nečistoty sa odstreďovaním odstránia. Adsorbované nukleové kyseliny sa prepláchnu a potom sa vylúhujú vodným roztokom. Množstvo genomickej DNA sa stanoví spektrofotometricky a upraví sa na fixnú koncentráciu, ktorá sa pridáva do amplifikačnej/detekčnej zmesi. Cieľová DNA sa následne amplifikuje a deteguje v analyzátore cobas z 480 pomocou amplifikačných a detekčných činidiel, ktoré sú súčasťou súpravy cobas EGFR Mutation Test. Časť s informáciami o revízii dokumentu je umiestnená na konci tohto dokumentu SK 1 Doc Rev. 1.0

2 Amplifikácia PCR Výber cieľa Súprava cobas EGFR Mutation Test používa priméry definujúce špecifické sekvencie základových párov pre každú z cielených mutácií. Pre mutácie G719X v exone 18 sú cielené sekvencie bázových párov od 104 do 106, pre mutácie s deléciou exonu 19 sú cielené sekvencie bázových párov od 125 do 141, pre mutáciu S768I v exone 20 je cielená sekvencia bázového páru 133, pre mutáciu T790M v exone 20 je cielená sekvencia bázového páru 118, pre vloženia v exone 20 sú cielené sekvencie bázových párov v rozsahu od 125 do 143, pre mutáciu L858R v exone 21 je cielený bázový pár 138. K amplifikácii dochádza len v rámci génu EGFR medzi primérmi; celý gen EGFR nie je amplifikovaný. Amplifikácia cieľa Derivát druhov Thermus Z05-AS1 DNA polymerázy sa využíva na amplifikáciu cieľa. Najprv sa reakčná zmes PCR zahreje za účelom denaturácie genómovej DNA a expozície cieľových sekvencií primérov. Pri chladnutí zmesi sa upstream a downstream priméry uvoľnia do cieľových DNA sekvencií. Polymeráza Z05 DNA v prítomnosti dvojmocného iónu kovu a pri prebytku dntp rozšíri každý uvoľnený primér, čím sa syntetizuje druhý reťazec DNA. Týmto sa ukončí prvý cyklus PCR, v ktorom získame kópiu dvojreťazcovej DNA obsahujúcej cieľové regióny základového páru génu EGFR. Tento proces sa opakuje v mnohých cykloch, pričom každý cyklus v skutočnosti zdvojnásobuje počet amplikónov DNA. Automatizovaná detekcia mutácie v reálnom čase cobas EGFR Mutation Test využíva technológiu PCR v reálnom čase. Každá cieľovo špecifická oligonukleotidová sonda je v reakcii označená fluorescentným farbivom, ktoré slúži ako signál, a molekulou tlmiča, pohlcujúcou (tlmiacou) fluorescentnú emisiu z farbiva signálu v neporušenej sonde. Pri každom cykle amplifikácie sa sonda komplementárna k sekvencii DNA s jedným reťazcom v amplikóne naviaže a následne sa rozštiepi účinkom 5' až 3' nukleázovej aktivity Z05-AS1 DNA polymerázy. V okamihu, keď následkom tejto nukleázovej aktivity dôjde k oddeleniu farbiva od tlmiča, môže byť nameraná fluorescencia s charakteristickou vlnovou dĺžkou signalizačného farbiva vybudená príslušnou časťou svetelného spektra. Na označovanie mutácií, cielených týmto testom, sa používajú štyri rôzne signalizačné farbivá. Amplifikácia šiestich sekvencií EGFR je detegovaná nezávisle v rámci troch reakcií meraním fluorescencie na štyroch charakteristických vlnových dĺžkach vo vyhradených optických kanáloch. Selektívna amplifikácia Selektívna amplifikácia cieľovej nukleovej kyseliny klinickej vzorky sa v cobas EGFR Mutation Test dosahuje použitím enzýmu AmpErase (uracil-n-glykozyláza) a deoxyuridín trifosfátu (dutp) 15. Enzým AmpErase rozpoznáva a katalyzuje rozpad reťazcov DNA obsahujúcich deoxyuridín, nie však DNA, ktorá obsahuje tymidín. Deoxyuridín sa v bežne existujúcej DNA nevyskytuje, vždy sa však vyskytuje v amplikóne a to v dôsledku použitia dutp namiesto deoxytymidín trifosfátu ako jedného z nukleotidových trifosfátov v Hlavnej zmesi; preto deoxyuridín obsahuje iba amplikón. Deoxyuridín spôsobuje citlivosť kontaminujúceho amplikóna na zničenie pomocou enzýmu AmpErase ešte pred amplifikáciou cieľovej DNA. Enzým AmpErase, ktorý je súčasťou činidla Hlavnej zmesi, katalyzuje rozpad DNA obsahujúcich deoxyuridín v zvyškoch deoxyuridínu tým, že otvára reťazec deoxyribózy v polohe C1. Pri zahrievaní v prvom kroku termocyklovania pri alkalickom ph sa reťazec amplikónovej DNA štiepi v mieste deoxyuridínu, čím sa DNA stáva neamplifikovateľnou. Enzým AmpErase je neaktívny pri teplotách nad 55 C, t.j. v priebehu krokov tepelného cyklu a preto nedochádza k zničeniu cieľového amplikóna. Bolo preukázané, že cobas EGFR Mutation Test inaktivuje najmenej 10 3 kópií amplikónu EGFR obsahujúceho deoxyuridín na jednu PCR SK 2 Doc Rev. 1.0

3 ČINIDLÁ cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 testov Súprava na prípravu vzoriek DNA cobas (P/N: ) DNA TLB 1 x 10 ml (Roztok na dezintegráciu tkaniva DNA) Roztok Tris-HCl Chlorid draselný 0,04 % EDTA 0,1 % Triton X-100 0,09 % azid sodný PK 1 x 100 mg (Proteináza K) Proteináza K (lyofilizovaná) Xn Proteináza K Škodlivý DNA PBB (Pufor viažuci parafín DNA) Roztok Tris-HCl 49,6 % guanidín hydrochlorid 0,05 % močovina 17,3 % Triton X-100 Xn 49,6 % (w/w) Guanidín HCI 1 x 10 ml Škodlivý WB I (Výplachový pufor DNA I) Roztok Tris-HCl 64 % guanidín hydrochlorid Xn 64 % (w/w) Guanidín HCI 1 x 25 ml Škodlivý WB II (Výplachový pufor DNA II) Roztok Tris-HCl Chlorid sodný DNA EB (Lúhovací pufor DNA) Roztok Tris-HCl 0,09 % azid sodný FT (Filtračné skúmavky s uzávermi) CT (Zberné skúmavky) 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25 ks 3 x 25 ks SK 3 Doc Rev. 1.0

4 cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 testov (P/N: ) EGFR 2 x 0,4 ml (Hlavná zmes EGFR 1) Pufor Tris Chlorid draselný Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoxid 0,09 % azid sodný < 0,10 % dntps < 0,01 % polymeráza Z05-AS1 DNA (mikrobiálna) < 0,01 % enzým AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiálna) < 0,01 % aptamér < 0,01 % mediátorové a antimediátorové priméry EGFR < 0,01 % fluorescentne označené vzorky EGFR EGFR 2 x 0,4 ml (Hlavná zmes EGFR 2) Pufor Tris Chlorid draselný Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoxid 0,09 % azid sodný < 0,10 % dntps < 0,01 % polymeráza Z05-AS1 DNA (mikrobiálna) < 0,01 % enzým AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiálna) < 0,01 % aptamér < 0,01 % mediátorové a antimediátorové priméry EGFR < 0,01 % fluorescentne označené vzorky EGFR EGFR 2 x 0,4 ml (Hlavná zmes EGFR 3) Pufor Tris Chlorid draselný Glycerol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoxid 0,09 % azid sodný < 0,10 % dntps < 0,01 % polymeráza Z05-AS1 DNA (mikrobiálna) < 0,01 % enzým AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiálna) < 0,01 % aptamér < 0,01 % mediátorové a antimediátorové priméry EGFR < 0,01 % fluorescentne označené vzorky EGFR MGAC 6 x 0,2 ml (Octan horečnatý) Octan horečnatý 0,09 % azid sodný EGFR MC 6 x 0,1 ml (Kontrolná vzorka mutanta EGFR) Pufor Tris EDTA Poly-rA RNA (syntetická) 0,05 % azid sodný < 0,1 % plazmid DNA obsahujúci sekvencie EGFR exon 18, 19, 20 a 21 (mikrobiálne) <0,1 % EGFR štandardný DNA (bunková kultúra) DNA SD 2 x 3,5 ml (Rozpúšťadlo na vzorky DNA) Roztok Tris-HCl 0,09 % azid sodný SK 4 Doc Rev. 1.0

5 VÝSTRAHY A PREVENTÍVNE OPATRENIA A. URČENÉ NA DIAGNOSTICKÉ POUŽITIE IN VITRO. B. Tento test je určený na použitie so vzorkami FFPET NSCLC. C. Nepipetujte ústami. D. V pracovných zónach laboratória nejedzte, nepite ani nefajčite. E. Vyhnite sa mikrobiálnej kontaminácii činidiel a kontaminácii kyselinou DNA. F. Pri likvidácii nepoužitých činidiel a odpadu postupujte v súlade s platnými štátnymi a miestnymi predpismi. G. Nepoužívajte súpravy po uplynutí dátumu exspirácie. H. Nemiešajte reagencie z rôznych šarží alebo súprav. I. Musia sa nosiť rukavice a počas práce s rôznymi reagenciami sa musia meniť, aby sa predišlo kontaminácii. J. Aby sa zabránilo kontaminácii pracovnej hlavnej zmesi (pracovná MMX) vzorkami DNA, amplifikácia a detekcia sa musí uskutočňovať v oblasti oddelenej od izolácie DNA. Pred prípravou pracovnej MMX musí byť pracovný priestor oblasť amplifikácie a detekcie dôkladne vyčistený. Na dosiahnutie správneho vyčistenia sa všetky povrchy, vrátane stojanov a pipetorov musia dôkladne utrieť 0,5 % roztokom chlórnanu sodného a následne vyutierať 70 % roztokom etanolu. K. DNA PBB a WB I obsahujú guanidín hydrochlorid. Ak dôjde k rozliatiu kvapaliny obsahujúcej tento pufor, zasiahnutý priestor vyčistite laboratórnym detergentom a vodou. Ak rozliata kvapalina obsahuje potenciálne infekčné látky, zasiahnuté miesto najskôr vyčistite laboratórnym detergentom a vodou a následne 0,5 % roztokom chlórnanu sodného*. Ak k rozliatiu dôjde na analyzátore cobas z 480, postupujte podľa pokynov v príručke obsluhy analyzátora cobas z 480. *POZNÁMKA: Komerčne dostupné bielidlá pre domácnosti spravidla obsahujú 5,25 % koncentráciu chlórnanu sodného. Rozriedením bielidla používaného v domácnosti v pomere 1:10 dosiahnete 0,5 % koncentráciu chlórnanu sodného. L. So vzorkami by sa vždy malo zachádzať ako s infikovaným materiálom a vždy by sa mali dodržiavať bezpečné laboratórne postupy, uvedené napríklad v materiáli Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 a v dokumente CLSI M29-A3. 17 M. DNA TLB a DNA PBB obsahujú Triton X-100, dráždivý pre sliznice. Vyhýbajte sa kontaktu s očami, pokožkou a sliznicami. N. DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR, EGFR, EGFR, EGFR MC a DNA SD obsahujú azid sodný. Azid sodný môže reagovať s olovenými a medenými rozvodmi a môže dochádzať k tvorbe vysoko výbušných kovových azidov. Ak vylievate roztoky obsahujúce azid sodný do laboratórnych drezov, vypláchnite odvodné potrubia veľkým množstvom vody, čím zabránite zabudovaniu azidov. O. Xylén je nebezpečná chemikália a musí sa používať pod digestorom. Zneškodňovať ako chemický odpad v súlade s platnými miestnymi a celoštátnymi predpismi. P. Pri práci s každou reagenciou noste ochranu očí, laboratórne plášte a jednorazové rukavice. Vyhýbajte sa kontaktu týchto materiálov s kožou, očami a sliznicami. Ak dôjde ku kontaktu, zasiahnuté miesto ihneď umyte veľkým množstvom vody. V prípade neošetrenia môžu vzniknúť popáleniny. Ak dôjde k rozliatiu týchto činidiel, pred ich vysušením rozliate reagencie zrieďte vodou. Q. Všetky jednorazové položky sú určené na jedno použitie. Nepoužívajte ich opätovne. R. Pomôcky na jedno použitie nepoužívajte po uplynutí ich dátumu exspirácie. S. Na čistenie analyzátora cobas z 480 nepoužívajte roztok chlórnanu sodného (bielidlo). Analyzátor cobas z 480 čistite podľa postupov popísaných v Príručke zariadenia pre analyzátor cobas z 480. T. Ďalšie výstrahy, preventívne opatrenia a postupy na zníženie rizika kontaminácie analyzátora cobas z 480 sa uvádzajú v Príručke zariadenia pre analyzátor cobas z 480. U. Odporúča sa použitie sterilných jednorazových pipiet a horotov pipetora, neobsahujúcich Dnázy. POŽIADAVKY NA SKLADOVANIE A MANIPULÁCIU A. Okrem reagencie PK činidlá nezmrazujte. B. DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT a CT uchovávajte pri 15 C až 30 C. Po otvorení sú DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB a PK stabilné pri max. 8 použitiach počas 90 dní alebo do dátumu exspirácie, pričom platí to, čo nastane skôr. C. Po pridaní sterilnej vody bez obsahu nukleázy do PK uchovávajte pripravený PK v 450 µl alikvótoch pri -20 C. Po pripravení musí byť PK použitý počas 90 dní alebo do dátumu exspirácie, pričom platí to, čo nastane skôr. D. Po pridaní absolútneho etanolu uchovávajte WB I a WB II pri 15 C až 30 C. Tieto pracovné roztoky sú stále počas 90 dní alebo do dátumu exspirácie, pričom platí to, čo nastane skôr SK 5 Doc Rev. 1.0

6 E. MGAC, EGFR, EGFR, EGFR, EGFR MC a DNA SD uchovávajte pri 2 C až 8 C. Po otvorení sú tieto činidlá stále na 4 použitia za 90 dní alebo do dátumu exspirácie, pričom platí to, čo nastane skôr. F. EGFR, EGFR, EGFR a pracovná MMX (pripravená pridaním MGAC do EGFR alebo EGFR alebo EGFR ) sa musia chrániť pred dlhodobým pôsobením svetla. G. Pracovná MMX sa musí uchovávať pri 2 C až 8 C na tmavom mieste. Pripravené vzorky a kontrolné vzorky sa musia pridať do 1 hodiny po príprave hlavnej pracovnej zmesi. H. Spracované vzorky (extrahovanej DNA) sú stabilné max. 7 dní pri 15 C až 30 C, do 60 dní pri 2 C až 8 C, alebo do 60 dní pri -15 C až -20 C. Spracované vzorky sú stále tiež až 60 dní pri -15 C až -25 C po absolvovaní 3 zmrazení a roztopení. I. Amplifikácia sa musí začať do 1 hodiny od doby, kedy boli spracované vzorky a kontrolné vzorky pridané do pracovnej MMX (pripravenej doplnením MGAC do EGFR alebo EGFR alebo EGFR ). DODÁVANÉ MATERIÁLY A. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 testov Súprava na prípravu vzoriek DNA cobas (P/N: ) DNA TLB ((Pufor na dezintegráciu tkaniva DNA) PK (Proteináza K) DNA PBB (Pufor viažuci parafín DNA) WB I (Výplachový pufor DNA I) WB II (Výplachový pufor DNA II) DNA EB (Lúhovací pufor DNA) FT (Filtračné skúmavky s uzávermi) CT (Zberné skúmavky) B. cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 testov (P/N: ) MGAC (octan horečnatý) (uzáver so žltým gombíkom) EGFR (EGFR hlavná zmes 1) (uzáver s bielym gombíkom) EGFR (EGFR hlavná zmes 2) (uzáver so zlatým gombíkom) EGFR (EGFR hlavná zmes 3) (uzáver s modrozeleným gombíkom) EGFR MC (Kontrolná vzorka mutanta EGFR) (uzáver s červeným gombíkom) DNA SD (Rozpúšťadlo na vzorky DNA) SK 6 Doc Rev. 1.0

7 POTREBNÉ MATERIÁLY, KTORÉ NIE SÚ SÚČASŤOU DODÁVKY Xylén (Sigma, kat. č alebo Fisher Scientific, kat. č. X5-4, alebo ekvivalent) Absolútny etanol (Sigma, kat. č. E7023 alebo Fisher Scientific, kat. č. BP alebo ekvivalent) Izopropanol (Sigma, kat. č. # alebo Fisher Scientific, kat. č. A451-1 alebo ekvivalent) Sterilná voda, bez nukleázy (Applied Biosystems PCR, voda v kvalite PCR, kat. č. # AM9937 alebo Thermo Scientific voda v molekulárne biologickej vedeckej kvalite, kat. č. SH alebo ekvivalent) Sterilné jednorazové sérologické pipety: 5 a 25 ml Mikrotitračná platňa (platňa AD) a tesniaca fólia (Roche P/N ) systému cobas 4800 Aplikátor tesniacej fólie (Roche P/N ) systému cobas 4800 Nastaviteľné pipetory* (kapacita 10 µl, 20 µl, 200 µl a 1000 µl) s aerosólovou prepážkou alebo objemovými hrotmi neobsahujúce Dnázy* Pipetovacie zariadenie (Drummond P/N: alebo ekvivalentné) Stolová mikroodstredivka zabezpečujúca odstreďovanie 8000 x g a až x g (Eppendorf 5417C alebo ekvivalent)** Dva (2) zariadenia na tvorbu suchého tepla, ktoré zohrejú mikrocentrifugačné skúmavky na 56 C a 90 C** 1,5 ml mikrocentrifugačné skúmavky Safe-Lock, sterilné, bez Rnázy/Dnázy, triedy PCR (Eppendorf, kat. č ) Spektrofotometer Nanodrop UV-Vis (Thermo Scientific ND-1000 a ND-2000)** Vírivý mixér** Stojany na skúmavky do mikroodstredivky Jednorazové rukavice, bez púdru Kalibrované teplomery pre zariadenie na tvorbu suchého tepla** Vodný kúpeľ** na udržanie teploty 37 C Jednočepeľový nôž a podobne * Pipetory musia byť udržiavané v súlade s pokynmi výrobcu a presnosť do 3 % stanoveného objemu. Kvôli zamedzeniu znehodnotenia vzorky a krížovej kontaminácie je potrebné používať špičky pipiet s aerosólovou prepážkou alebo objemové hroty bez Dnázy. ** Všetko zariadenie sa musí riadne udržiavať podľa pokynov ich výrobcov. Zariadenia a softvér Analyzátor cobas z 480 Riadiaca jednotka systému cobas 4800 SR2 s obrazom softvéru OSXP Systémový softvér cobas 4800 SR2, verzia 2.0 Softvérový balík EGFR Analysis Package Software, verzia 1.0 Ext. USB snímača čiarového kódu Tlačiareň HP P2055d ODBER, PREPRAVA A SKLADOVANIE VZORIEK POZNÁMKA: So všetkými vzorkami narábajte ako so vzorkami schopnými prenášať zdroje infekcií. A. Odber vzoriek Vzorky NSCLC FFPET boli validované na použitie s cobas EGFR Mutation Test. B. Preprava vzoriek Vzorky NSCLC FFPET možno prepravovať pri 15 C až 30 C. Preprava vzoriek so vzorkami FFPET musí spĺňať požiadavky štátnych, federálnych a miestnych predpisov na prepravu etiologických materiálov. 14 C. Skladovanie vzoriek Vzorky NSCLC FFPET môžu byť uchovávané pri 15 C až 30 C max. 12 mesiacov od dátumu odberu tkaniva. Sekcie s hrúbkou 5 µm na sklíčkach môžu byť uchovávané pri 15 C až 30 C max. 30 dní SK 7 Doc Rev. 1.0

8 NÁVOD NA POUŽITIE POZNÁMKA: V cobas EGFR Mutation Test možno používať iba sekcie NSCLC FFPET s hrúbkou 5 µm obsahujúce najmenej 10 % nádorovej plochy. Vzorky obsahujúce menej ako 10 % nádorovej plochy musia byť po odparafínovaní oddelené makrodisekciou. POZNÁMKA: Podrobné pokyny na použitie analyzátora cobas z 480 sa uvádzajú v Príručke zariadenia pre analyzátor cobas z 480. POZNÁMKA: Zariadenia na tvorbu suchého tepla na zohriatie mikrocentrifugačných skúmaviek sa musia zapnúť a nastaviť na 56 C a 90 C. Rozsah cyklu Rozsah cyklu môže byt 1 až 30 vzoriek (plus kontrolné vzorky) na jednu mikrotitračnú platňu s 96 jamkami. Pri cykloch s viac než 24 vzorkami budú potrebné súpravy cobas EGFR Mutation Test. cobas EGFR Mutation Test obsahuje dostatočné množstvo činidiel na 8 cyklov po 3 vzorky (plus kontrolné vzorky) maximálne pre 24 vzoriek na jednu súpravu. Pracovný postup Testovací postup s cobas EGFR Mutation Test spočíva v ručnej príprave vzoriek pomocou súpravy na prípravu vzoriek DNA cobas, nasledovanej amplifikáciou na analyzátore cobas z 480 pomocou súpravy cobas EGFR Mutation Test. Príprava činidla A. Proteináza K (PK) sa pripraví pridaním 4,5 ml sterilnej vody bez obsahu nukleázy (triedy PCR) do liekovky pomocou sterilnej 5-ml sérologickej pipety. Premiešajte skúmavku prevracaním 5 až 10 krát. Naalikvotujte 450 µl nariedenej PK do 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek Safe-Lock a uchovávaje pri -20 C. Ak proteináza K už bola už bola nariedená a uložená do mrazničky, dostatočný počet podielov spracovať počet vzoriek sa má spustiť pred deparaffinization (70 μl rozpusteného PK je nutné pre každú vzorku). B. Všetky roztoky uchovávané pri C by mali byť číre. Ak sú v niektorom činidle prítomné usadeniny, roztok zohrejte vo vodnom kúpeli na 37 C, kým sa usadenina nerozpustí. Nepoužívajte, kým sa nerozpustí všetka usadenina. C. Pripravte pracovný výplachový pufor DNA I (WB I) pridaním 15 ml absolútneho etanolu do fľaše WB I. Premiešajte fľašu prevracaním 5 až 10 krát. Poznamenajte si na fľaši, že bol pridaný etanol a dátum. Pracovný WB I uchovávajte pri teplote 15 C až 30 C. D. Pripravte pracovný výplachový pufor DNA I (WB II) pridaním 50 ml absolútneho etanolu do fľaše WB II. Premiešajte fľašu prevracaním 5 až 10 krát. Poznamenajte si na fľaši, že bol pridaný etanol a dátum. Pracovný WB II uchovávajte pri teplote 15 C až 30 C. Odparafínovanie sekcií FFPET namontovaných na sklíčkach POZNÁMKA: Xylén je nebezpečná chemikália. Všetky kroky odparafínovania by sa mali vykonávať pod digestorom. Pozri Výstrahy a preventívne opatrenia. A. Sklíčko s namontovanou 5 µm FFPET sekciou preneste do nádoby s dostatočným množstvom xylénu na zakrytie tkaniva; namočte na 5 minút. B. Preneste sklíčka do nádoby s dostatočným množstvom absolútneho etanolu na zakrytie tkaniva; namočte na 5 minút. C. Vyberte sklíčko z etanolu a sekciu nechajte úplne vyschnúť na vzduchu (5 až 10 minút). D. Ak vzorka obsahuje menej ako 10 % nádorovej plochy, vykonajte makrodisekciu. E. Označte jednu mikrocentrifugačnú 1,5 ml skúmavku Safe-Lock identifikačnými informáciami vzorky. F. Pridajte 180 µl DNA TLB do 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavky Safe-Lock. G. Pridajte 70 µl rekonštituovanej PK do skúmavky Safe-Lock obsahujúcej DNA TLB. H. Zotrite tkanivo zo sklíčka do skúmavky Safe-Lock. Ponorte tkanivo do zmesi DNA TLB/PK. I. Pokračujte krokom A Postupu izolácie DNA SK 8 Doc Rev. 1.0

9 Odparafínovanie sekcií FFPET nenamontovaných na sklíčkach POZNÁMKA: Xylén je nebezpečná chemikália. Všetky kroky odparafínovania by sa mali vykonávať pod digestorom. Pozri Výstrahy a preventívne opatrenia. POZNÁMKA: Ak vzorka obsahuje menej ako 10 % nádorovej plochy, táto sekcia sa musí namontovať na sklíčko na makrodisekciu a ďalej sa riaďte postupom uvedeným v časti Odparafínovanie sekcií FFPET namontovaných na sklíčkach. A. Vložte jednu 5 µm sekciu FFPET do 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavky Safe-Lock označenej identifikačnými informáciami pre každú vzorku. B. Pridajte 500 µl xylénu do skúmavky Safe-Lock obsahujúcej sekciu FFPET. C. Dôkladne premiešajte 10 sekúnd vo vírivom mixéri. D. Nechajte skúmavku stáť 5 minút pri 15 C až 30 C. E. Pridajte 500 µl absolútneho etanolu a obsah zmiešajte vo vírivom mixéri 10 sekúnd. F. Nechajte skúmavku stáť 5 minút pri 15 C až 30 C. G. Odstreďujte pri rýchlosti x g až x g po dobu 2 minút. Odstráňte kal bez toho, aby sa poškodila granuly. Kal zlikvidujte do chemického odpadu. H. Pridajte 1 ml absolútneho etanolu a obsah miešajte vo vírivom mixéri 10 sekúnd. I. Odstreďujte pri rýchlosti x g až x g po dobu 2 minút. Odstráňte kal bez toho, aby sa poškodila granuly. Kal zlikvidujte do chemického odpadu. POZNÁMKA: Ak peleta pláva v zvyšnom supernatante, odstreďujte ju znova 1 minútu pri x g až x g. Odstráňte všetok zvyšený supernatant. J. Suchú peletu tkaniva sušte po dobu 10 minút pri 56 C v zariadení na tvorbu tepla s otvorenou skúmavkou. POZNÁMKA: Dbajte, aby sa etanol úplne odparil a aby sa peleta vysušila skôr, ako prejdete k ďalšiemu kroku. POZNÁMKA: V prípade potreby možno suché pelety skladovať až 24 hodín pri teplote 2 C až 8 C. K. Resuspendujte peletu tkaniva v 180 µl roztoku na dezintegráciu tkaniva DNA (DNA TLB). L. Pridajte 70 µl rekonštituovanej PK. M. Pokračujte krokom A Postupu izolácie DNA. PRÍPRAVA VZORKY Postup izolácie DNA POZNÁMKA: Negatívnu kontrolnú vzorku spracovávajte súčasne so vzorkou (-ami). Pripravte negatívne kontroly skombinovaním 180 µl roztok na dezintegráciu tkaniva (DNA TLB) a 70 µl roztoku PK v 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavke Safe-Lock označenej ako NEG CT. Negatívne kontroly sa musia spracovať rovnakým postupom ako vzorky. A. Skúmavky so zmesou vzorky/dna TLB/PK a zmesou negatívnej kontroly (NEG CT) miešajte 30 sekúnd vo vírivom mixéri. POZNÁMKA: Tkanivo musí byť úplne ponorené do zmesi DNA TLB/PK. B. Skúmavky vložte do zariadenia na tvorbu suchého tepla pri teplote 56 C a inkubujte 60 minút. C. Skúmavky miešajte 10 sekúnd vo vírivom mixéri. POZNÁMKA: Tkanivo musí byť úplne ponorené do zmesi DNA TLB/PK. D. Skúmavky vložte do zariadenia na tvorbu suchého tepla pri teplote 90 C a inkubujte 60 minút. POZNÁMKA: Počas inkubácie pripravte požadovaný počet filtračných skúmaviek (FT) s odklápacie uzávermi tak, že FT vložíte do zbernej skúmavky (CT) a označením každého uzáveru FT identifikáciou samotnej vzorky alebo kontrolnej vzorky. POZNÁMKA: Každá vzorka si bude vyžadovať 1 FT, 3 CT a 1 lúhovaciu skúmavku (1,5 ml mikrocentrifugačné skúmavky). POZNÁMKA: Počas inkubácie označte požadovaný počet lúhovacích skúmaviek (1,5 ml mikrocentrifugačná skúmavka) identifikačnými informáciami samotnej vzorky alebo kontrolnej vzorky. E. Skúmavky nechajte vychladnúť na 15 C až 30 C. Po ochladení skúmavky impulzovo odstreďte, aby sa z uzáverov zozberala tekutina. F. Pridajte 200 µl DNA PBB do každej skúmavky, premiešajte ju trojnásobným napipetovaním nahor a nadol. G. Vykonajte inkubáciu 10 minút pri teplote 15 C až 30 C SK 9 Doc Rev. 1.0

10 H. Pridajte do každej skúmavky 100 µl izopropanolu, lyzát premiešajte trojnásobným napipetovaním nahor a nadol. I. Preneste všetky lyzáty do vhodne označenej jednotky FT/CT. J. Jednotky FT/CT odstreďujte rýchlosťou 8000 x g po dobu 1 minút. K. Každú FT položte na novú CT. Zlikvidujte pretokovú frakciu zo starej CT ako chemický odpad a riadne zlikvidujte použitú CT. L. Pridajte 500 µl pracovného WB I do každej FT. POZNÁMKA: Príprava pracovného WB I je popísaná v časti Príprava činidla. M. Jednotky FT/CT odstreďujte rýchlosťou 8000 x g po dobu 1 minút. N. Pretokovú frakciu v každom CT zlikvidujte ako chemický odpad. FT vložte späť do tej istej CT. O. Pridajte 500 µl pracovného WB II do každej FT. POZNÁMKA: Príprava pracovného WB II je popísaná v časti Príprava činidla. P. Jednotky FT/CT odstreďujte rýchlosťou 8000 x g po dobu 1 minút. Q. Každú FT položte na novú CT. Zlikvidujte pretokovú frakciu zo starej CT ako chemický odpad a riadne zlikvidujte použitú CT. R. Jednotky FT/CT odstreďujte 1 minútu rýchlosťou až x g, aby sa vysušili filtračné membrány. S. Vložte každý FT do lúhovacej skúmavky (1,5 ml mikrocentrifugačná skúmavka) vopred označenej identifikačnými informáciami vzorky alebo kontrolnej vzorky. Zlikvidujte pretokovú frakciu z použitej CT ako chemický odpad a riadne zlikvidujte použitú CT. T. Pridajte 100 µl DNA EB do stredu každej membrány FT bez dotyku membrány FT. U. Vykonajte inkubáciu FT s lúhovacou skúmavkou 5 minút pri teplote 15 C až 30 C. V. FT odstreďujte 1 minútu s lúhovacou skúmavkou rýchlosťou 8000 x g, aby sa eluát zozberal do lúhovacej skúmavky. Použité FT správne zlikvidujte. W. Uzavrite uzáver lúhovacej skúmavky. Lúhovaca skúmavka obsahuje kmeň DNA. Prejdite na krok A v časti Kvantifikácia DNA. POZNÁMKA: Meranie koncentrácie DNA by sa malo uskutočniť bezprostredne po postupe izolácie DNA a pred uskladnením. Kvantifikácia DNA: A. Každý kmeň DNA premiešajte vo vírivom mixéri po dobu 5 sekúnd. B. DNA kvantifikujte pomocou spektrofotometra Nanodrop UV-Vis (ND-1000 alebo ND-2000) podľa protokolu výrobcu. DNA EB použite pre tento prístroj ako kontrolu. Potrebný je priemer dvoch konzistentných zobrazovaných údajov. Tieto dve merania by mali byť v rozmedzí ± 10 % od seba, ak sú hodnoty koncentrácie DNA 20,0 ng/µl. Pri hodnotách koncentrácie DNA < 20,0 ng/µl by tieto dve merania mali ležať v rozmedzí ± 2 ng/µl. Ak tieto dve merania nie sú v rámci ± 10 % od seba pri hodnotách koncentrácie DNA 20,0 ng/µl alebo v rámci ± 2 ng/µl pri hodnotách koncentrácie DNA < 20,0 ng/µl, musia byť určené ďalšie 2 hodnoty, kým nebudú tieto požiadavky splnené. Potom je potrebné vypočítať priemer z týchto dvoch meraní. POZNÁMKA: Kmeň DNA zo spracovanej negatívnej kontroly (NEG CT) nie je potrebné merať. C. Koncentrácia kmeňa DNA zo vzoriek musí byť 2 ng/µl, aby sa mohol vykonať cobas EGFR Mutation Test. Pre každú vzorku sa uskutočnia tri amplifikácie/detekcie pomocou 25 µl nariedeného kmeňa DNA 2 ng/µl (celkom 50 ng DNA) pre každú amplifikáciu/detekciu. POZNÁMKA: Každý kmeň DNA musí mať minimálnu koncentráciu 2 ng/µl, aby mohol byť uskutočnený cobas EGFR Mutation Test. Ak je koncentrácia kmeňa DNA < 2 ng/µl, zopakujte postupy odparafínovania, izolácie DNA a kvantifikácie DNA pre túto vzorku pomocou dvoch 5 µm sekcií FFPET. Pre namontované vzorky po odparafínovaní skombinujte tkanivo z oboch sekcií do jednej skúmavky, ponorte tkanivo do DNA TLB + PK a vykonajte izoláciu a kvantifikáciu DNA, ako je popísané vyššie. Pre nenamontované vzorky skombinujte obe sekcie do jednej skúmavky a ponorte tkanivo do DNA TLB + PK a vykonajte izoláciu a kvantifikáciu DNA, ako je popísané vyššie. Ak je kmeň DNA naďalej < 2 ng/µl, vyžiadajte si od odporúčajúceho klinického pracoviska ďalšiu vzorku FFPET. POZNÁMKA: Kmeň DNA (spracovanú vzorku a negatívnu kontrolnú vzorku) skladujte pri teplote 2 C + 8 C po dobu max. 2 týždňov alebo pri teplote -20 C po dobu max. 60 dní SK 10 Doc Rev. 1.0

11 AMPLIFIKÁCIA A DETEKCIA POZNÁMKA: Aby sa zabránilo kontaminácii pracovnej MMX vzorkami DNA, amplifikácia a detekcia sa musí uskutočňovať v oblasti oddelenej od izolácie DNA. Pred prípravou pracovnej MMX musí byť pracovný priestor oblasť amplifikácie a detekcie dôkladne vyčistený. Na dosiahnutie správneho vyčistenia sa všetky povrchy, vrátane stojanov a pipetorov, musia dôkladne utrieť 0,5 % roztokom chlórnanu sodného a následne vyutierať 70 % roztokom etanolu. Komerčne dostupný tekutý bieliaci roztok obvykle obsahuje chlórnan sodný v koncentrácii 5,25 %. Rozriedením bielidla používaného v domácnosti v pomere 1:10 dosiahnete 0,5 % koncentráciu chlórnanu sodného. Nastavenie zariadenia: Podrobné pokyny na nastavenie analyzátora cobas z 480 sa uvádzajú v Príručke zariadenia pre analyzátor cobas z 480. Nastavenie testovacieho príkazu: Pozrite si Príručku obsluhy systému cobas 4800, verzia softvéru 2.0 pre cobas EGFR Mutation Test (Príručku obsluhy cobas EGFR) s podrobnými pokynmi pracovného postupu EGFR. Výpočet riedenia vzorky kmeňa DNA: Výpočet riedenia pre koncentrácie kmeňa DNA od 2 ng/μl do 36 ng/µl POZNÁMKA: Kmene DNA zo vzoriek sa musia nariediť bezprostredne pred amplifikáciou a detekciou. POZNÁMKA: Pre každú vzorku sa uskutočnia tri (3) amplifikácie/detekcie, čo si vyžiada celkový objem 75 µl (25 µl na každú z troch reakcií) nariedeného kmeňa DNA 2 ng/µl (celkom 150 ng DNA). A. Pre každú vzorku vypočítajte objem (µl) potrebného kmeňa DNA: µl kmeňa DNA = (90 µl x 2 ng/µl) koncentrácia kmeňa DNA [ng/µl] B. Pre každú vzorku vypočítajte potrebný objem (µl) rozpúšťadla na vzorky DNA (DNA SD): µl DNA SD = 90 µl - µl kmeňa DNA Príklad: Koncentrácia kmeňa DNA = 6,5 ng/µl A. µl kmeňa DNA = (90 µl x 2 ng/µl) 6,5 ng/µl = 27,7 µl B. µl DNA SD = (90 µl 27,7 µl) = 62,3 µl Výpočet riedenia pre koncentrácie kmeňa DNA > 36 ng/μl POZNÁMKA: Kmene DNA zo vzoriek sa musia nariediť bezprostredne pred amplifikáciou a detekciou. POZNÁMKA: Pre každú vzorku sa uskutočnia tri (3) amplifikácie/detekcie, čo si vyžiada celkový objem 75 µl (25 µl na každú z troch reakcií) nariedeného kmeňa DNA 2 ng/µl (celkom 150 ng DNA). A. Pri koncentráciách kmeňa DNA > 36 ng/µl použite nasledujúci vzorec na výpočet množstva riedidla na vzorky DNA (DNA SD) potrebného na prípravu minimálne 90 µl zriedeného kmeňa DNA. Týmto sa musí zabezpečiť, aby sa na každú vzorku použilo minimálne 5 µl kmeňa DNA. B. Pre každú vzorku vypočítajte potrebný objem (µl) DNA SD potrebného na nariedenie 5 µl kmeňa DNA na 2 ng/µl: Požadovaný objem DNA SD v µl = ((5 µl kmeňa DNA x koncentrácia kmeňa DNA v ng/µl) / 2 ng/µl) 5 µl Príklad: Koncentrácia kmeňa DNA = 100 ng/µl A. Požadovaný objem DNA SD v µl = ((5 µl x 100 ng/µl) / 2 ng/µl) 5 µl = 245 µl B. Použite vypočítané množstvo DNA SD na nariedenie 5 μl kmeňa DNA. Riedenie vzorky A. Pripravte príslušný počet 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek Safe-Lock na nariedenia DNA ich označením príslušnými identifikačnými informáciami vzorky. B. Pomocou pipetora s hrotom odolným proti aerosólom napipetujte vypočítané množstvá DNA SD do patrične označených skúmaviek. Napipetujte 45 µl DNA SD do skúmavky Safe-Lock označených ako NEG CT. C. Každý kmeň DNA a negatívny kontrolný roztok premiešajte vo vírivom mixéri po dobu 5 až 10 sekúnd. D. Pomocou pipetora s hrotom pipety odolným proti aerosólom (nový hrot pre každé pipetovanie) jemne napipetujte vypočítaný objem každého kmeňa DNA do príslušnej skúmavky obsahujúcej DNA SD. Napipetujte 45 µl negatívnej kontrolnej vzorky (extrahovaný eluát) do skúmavky NEG CT SK 11 Doc Rev. 1.0

12 E. Skúmavky uzavrite a obsah miešajte 5-10 sekúnd. F. Vymeňte si ochranné rukavice. Príprava pracovných hlavných zmesí (, a ) POZNÁMKA: EGFR, EGFR, EGFR a pracovná MMX sú svetlocitlivé a musia sa chrániť pred dlhodobým pôsobením svetla. POZNÁMKA: Vzhľadom na viskozitu zmesí EGFR a pracovných MMX sa musí pipetovať pomaly, aby sa všetky zmesi úplne uvoľnili od hrotu. POZNÁMKA: EGFR, EGFR a EGFR môže byť bledomodrý až nafialovelý. Na účinnosť reagencie to nemá vplyv. Pripravte tri veľké pracovné MMX, z ktorých jedna obsahuje EGFR, jedna obsahuje EGFR a ďalšia obsahuje EGFR do samostatných 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek Safe-Lock. A. Vypočítajte objem EGFR alebo EGFR alebo EGFR potrebný na každú pracovnú MMX pomocou nasledujúceho vzorca: Požadovaný ojem EGFR alebo EGFR alebo EGFR = (počet vzoriek + 2 kontroly +1) x 20 µl B. Vypočítajte objem MGAC potrebný pre každú pracovnú MMX podľa nasledujúceho vzorca: Požadovaný objem MGAC = (počet vzoriek + 2 kontroly + 1) x 5 µl Podľa tabuľky 1 stanovte objem všetkých reagencií potrebných na prípravu pracovného MMX na základe počtu vzoriek zahrnutých do cyklu. Tabuľka 1 Potrebné objemy reagencií pre pracovnú, pracovnú a pracovnú Č. vzoriek* MMX 20 µl MGAC 5 µl Celkový objem každého pracovného MMX (µl) * Objemy pre počty vzoriek sú založené na súčte počtu vzoriek + 2 kontroly + 1 C. Vyberte príslušný počet liekoviek s EGFR, EGFR, EGFR a MGAC z chladničky, kde boli uchovávané pri teplote od 2 C do 8 C. Každú reagenciu odstreďujte 5 sekúnd a pred použitím zozbierajte tekutinu v spodnej časti skúmavky. Označte sterilnú mikrocentrifugačnú skúmavku pre pracovnú, pracovnú a pracovnú. D. Pridajte vypočítaný objem EGFR alebo EGFR alebo EGFR do každej príslušnej skúmavky s pracovnou MMX. E. Pridajte vypočítané množstvo MGAC do skúmaviek s pracovným MMX. F. Skúmavky dôkladne premiešajte pomocou vírivého mixéra po dobu 3 až 5 sekúnd. POZNÁMKA: Vzorky a kontrolné vzorky by mali pridané na mikrotitračnú platňu (AD-platňu) do 1 hodiny po príprave pracovné MMX. POZNÁMKA: Používajte iba mikrotitračnú platňu (platňa AD) a tesniacu fóliu (Roche P/N ) systému cobas SK 12 Doc Rev. 1.0

13 Príprava platne Obrázok 1 Ukážka usporiadania platne Obrázok 1. Usporiadanie platne pre cobas EGFR Mutation Test Riadok / stĺpec A B C D E F G H MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 Kde: NEG = negatívna kontrola, MUT = mutantová kontrola, S# = identifikátor vzorky a MMX# zodpovedá reagencii hlavnej zmesi 1, 2 alebo 3. POZNÁMKA: Každá daná vzorka musí byť rozdelená do troch po sebe idúcich stĺpcov v jednom rade, aby vygenerovala výsledok. A. Napipetujte 25 µl pracovnej MMX do každej reakčnej jamky mikrotitračnej platne (AD-platňa), potrebnej pre tento cyklus. Nedovoľte, aby sa hrot pipetora dotýkal platne mimo jamky. Pridajte pracovnú (obsahujúcu EGFR ) do jamiek mikrotitračnej platne (AD-platňu) v stĺpcoch 1, 4, 7 a 10, ako je potrebné. Pridajte pracovnú (obsahujúcu EGFR ) do jamiek mikrotitračnej platne (AD-platňu) v stĺpcoch 2, 5, 8 a 11, ako je potrebné. Pridajte pracovnú (obsahujúcu EGFR ) do jamiek mikrotitračnej platne (AD-platňu) v stĺpcoch 3, 6, 9 a 12, ako je potrebné. B. Napipetujte 25 µl EGFR MC do jamiek A1, A2 a A3 mikrotitračnej platne (platňa AD), pipetou poriadne premiešajte najmenej dvojnásobným natiahnutím a vytlačením v rámci jamky. C. Použitím nového hrotu pipetora napipetujte 25 µl NEG CT do jamiek B1, B2 a B3 mikrotitračnej platne (platňa AD), pipetou poriadne premiešajte najmenej dvojnásobným natiahnutím a vytlačením v rámci jamky. POZNÁMKA: Každý cyklus musí obsahovať pozitívnu kontrolu (EGFR MC) v jamkách A1, A2 a A3 a negatívnu kontrolu (NEG CT) v jamkách B1, B2, B3, inak bude cyklus vyhodnotený ako neplatný analyzátorom cobas z 480. POZNÁMKA: Podľa potreby si vymeňte rukavice, na ochranu pred vzájomnou kontamináciou vzoriek a vonkajšou kontamináciou reakčnej skúmavky PCR. D. Pomocou nových hrotov pipetora pre každú vzorku DNA pridajte 25 µl prvej vzorky DNA do jamiek C1, C2 a C3 mikrotitračnej platne (platňa AD), na pridanie DNA vzorky do každej jamky použite nový hrot; pipetou poriadne vzorku premiešajte najmenej dvojnásobným natiahnutím a vytlačením v rámci jamky. Zopakujte tento postup so zriedenou DNA z druhých vzoriek (jamky D1, D2 a D3). Postupujte podľa šablóny na obrázku 1, kým sa nariedenia všetkých vzoriek DNA nenapipetujú do mikrotitračnej platne (AD-platne). Skontrolujte, či sa na dne jamiek zhromaždila všetka kvapalina. E. Mikrotitračnú platňu (AD-platňa) zakryte tesniacou fólie (dodávanou s platňami). Na pevné utesnenie fólie k mikrotitračnej platni (AD-platni) použite aplikátor tesniacej fólie. F. Pred začatím PCR si overte, či je všetka kvapalina zhromaždená na dne každej jamky. POZNÁMKA: Amplifikácia a detekcia by mala byť začatá do 1 hodiny po pridaní prvého nariedenia vzorky DNA do pracovnej MMX SK 13 Doc Rev. 1.0

14 Spustenie PCR Pozrite si Príručku obsluhy cobas EGFR s podrobnými pokynmi pracovného postupu EGFR. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV POZNÁMKA: Validáciu všetkých cyklov uskutočňuje softvér cobas POZNÁMKA: Platný (valídny) cyklus môže zahŕňať platné aj neplatné výsledky vzoriek. Pri platnom cykle sa výsledky vzoriek interpretujú podľa tabuľky 2. Tabuľka 2 Interpretácia výsledkov cobas EGFR Mutation Test Výsledky testu Výsledok mutácie Interpretácia Mutation Detected Exon 19 Delécia S768I L858R T790M G719X (G719A, G719C, G719S) Exon 20 Vloženie (Môže byť prítomných viac mutácií) Mutácia v cielenom regióne EGFR bola zistená. Mutation Not nedostupné Mutácia v cielených regiónoch EGFR nezistená Detected* Invalid nedostupné Výsledok vzorky je neplatný. Zopakujte testovanie vzoriek s neplatnými výsledkami podľa pokynov uvedených nižšie v časti Opakované testovanie vzoriek s neplatnými výsledkami. Failed nedostupné Cyklus nebol úspešný z dôvodu poruchy hardvéru alebo softvéru. Kontaktujte miestne zastupiteľstvo spoločnosti Roche a požiadajte o technickú podporu. *Mutácia nezistená nevylučuje prítomnosť mutácie v cielených regiónoch EGFR, nakoľko výsledky závisia od percenta sekvencií mutantu, dostatočnej integrity vzoriek, absencie inhibítorov a dostatočného množstva DNA na detekciu. Opakované testovanie vzoriek s neplatnými výsledkami A. Zopakujte nariedenie neplatnej vzorky kmeňa DNA počínajúc postupmi Výpočet riedenia vzorky kmeňa DNA a Riedenie vzorky v časti AMPLIFIKÁCIA A DETEKCIA. B. Po vykonaní nariedenia kmeňa DNA na 2 ng/µl, popísaného v časti Riedenie vzorky, pokračujte na Príprava pracovných hlavných zmesí (, a ) a zvyšnými krokmi postupu amplifikácie a detekcie. POZNÁMKA: Ak vzorka zostáva po opätovnom testovaní neplatná, alebo ak nemáte dostatok kmeňa DNA na prípravu ďalšieho nariedenia podľa časti Opakované testovanie vzoriek s neplatnými výsledkami, krok A, zopakujte celý postup skúšky pre danú vzorku, počnúc Odparafínovaním a Izoláciou DNA použitím novej 5 µm sekcie FFPET. KONTROLA KVALITY Do každého cyklu s najviac 30 vzorkami sa zahrnie jedna súprava cobas EGFR Test Mutant Control (EGFR MC) a negatívna kontrolná vzorka (NEG CT) pre pracovnú, pracovnú a pracovnú. Cyklus je platný, ak sú platné jamky EGFR Mutant Control (EGFR MC) (A1, A2 a A3) a negatívnej kontrolnej vzorky (NEG CT) (B1, B2 a B3). Ak je EGFR Mutant Control (EGFR MC) alebo negatívna kontrolná vzorka (NEG CT) pre pracovnú alebo pracovnú alebo pracovnú neplatná, celý beh je neplatný a musí sa zopakovať. Pripravte si čerstvé nariedenie už predtým izolovanej vzorky kmeňa DNA na vytvorenie novej mikrotitračnej platne (platne AD) s kontrolnými vzorkami na amplifikáciu a detekciu. Pozitívna kontrola Výsledok pre kontrolnú vzorku mutanta EGFR (EGFR MC) musí byť Valid pre pracovnú, pracovnú a pracovnú. Ak sú výsledky EGFR MC neustále neplatné, kontaktujte miestne zastupiteľstvo spoločnosti Roche a požiadajte o technickú podporu. Negatívna kontrolná látka Výsledok pre negatívnu kontrolnú vzorku (NEG CT) musí byť Valid pre pracovnú, pracovnú a pracovnú. Ak sú výsledky NEG CT neustále neplatné, kontaktujte miestne zastupiteľstvo spoločnosti Roche a požiadajte o technickú podporu SK 14 Doc Rev. 1.0

15 PROCEDURÁLNE PREVENTÍVNE OPATRENIA Tak, ako pri každej testovacej procedúre, aj v tomto prípade platí, že základom pre správne vykonanie tejto analýzy je správna laboratórna technika. Vzhľadom na vysokú analytickú citlivosť tohto testu je potrebné zachovať najvyššiu opatrnosť pri uchovaní čistoty reagencií a amplifikačných zmesí. PROCEDURÁLNE OBMEDZENIA 1. Testy vykonávajte výlučne s určenými typmi vzoriek. cobas EGFR Mutation Test bol validovaný len na použitie so vzorkami NSCLC FFPET. 2. cobas EGFR Mutation Test bol validovaný iba pomocou súpravy na prípravu vzoriek DNA cobas (Roche P/N: ). 3. Detekcia mutácie závisí od počtu kópií prítomných vo vzorke a môže byť ovplyvnená integritou vzorky, množstvom izolovanej DNA a prítomnosťou rušivých látok. 4. Spoľahlivé výsledky závisia od správnych postupov fixácie vzoriek, ich prepravy, uchovávania a spracovania. Dodržte postupy uvedené v tomto príbalovom letáku a v Príručke obsluhy cobas EGFR. 5. Efekty ďalších potenciálnych premenných, ako sú napríklad premenné fixácie vzorky, neboli hodnotené. 6. Pridanie enzýmu AmpErase do hlavnej zmesi cobas EGFR Mutation Test umožňuje vykonať selektívnu amplifikáciu cieľovej DNA; je však potrebné pripomenúť, že prevencia kontaminácie reagencií si vyžaduje dodržiavanie správnej laboratórnej praxe a procedúr uvedených v tomto príbalovom letáku. 7. Tento produkt môže používať len personál zaškolený v technikách PCR a použití systému cobas Na použitie s týmto výrobkom bol schválený len analyzátor cobas z 480. S týmto výrobkom sa nesmie používať žiadny iný tepelný cyklovač s optickou detekciou v reálnom čase. 9. V dôsledku základných odlišností medzi technológiami sa odporúča, aby používateľ pred zmenou technológie v laboratóriu vykonal štúdie korelácie metódy s cieľom kvantifikácie technologických rozdielov. 10. Napriek tomu môžu zriedkavé mutácie v rámci regiónov genomickej DNA génu EGFR, pokryté primérmi cobas EGFR Mutation Test alebo vzorkami, vyústiť do neúspechu pri detegovaní prítomnosti mutácie. 11. Prítomnosť inhibítorov PCR môže viesť k falošným negatívnym, alebo neplatným výsledkom. 12. Hoci zriedkavo, cobas EGFR Mutation Test vykazuje výsledky Mutation Not Detected (Mutácia nezistená) pre niektoré mutácie, a obmedzenú krížovú reaktivitu (výsledky Mutation Detected [Mutácia zistená]) pre mutácie lemujúce cielené mutácie v exone 18, 19, 20, a cobas EGFR Mutation Test bol validovaný na použitie s 50 ng DNA na jednu reakčnú jamku. Vstupné množstvá DNA menšie ako 50 ng na jednu reakčnú jamku nie sú odporúčané. NEKLINICKÉ VÝKONOVÉ HODNOTENIE Analytická citlivosť Analytická citlivosť cobas EGFR Mutation Test použitím plazmidových zmesí Šesť plazmidových obrazcov DNA obsahujúcich najčastejšie pozorované mutácie pre každú mutačnú triedu detegovanú testom bolo zmiešaných so štandardnou DNA bunkovej línie do cielenej konečnej kompozície 5 % mutantnej sekvencie založenej na genomických ekvivalentoch DNA. Boli pripravené sériové nariedenia 5 % kmeňov s mutantnou sekvenciou a testovalo sa 24 replikátov každého člena panela využitím každej z 3 šarží súpravy cobas EGFR Mutation Test. Analytická citlivosť bola stanovená najnižším množstvom DNA, ktoré prinášalo EGFR Mutation Detected s pravdepodobnosťou najmenej 95 % pre cielenú mutáciu a uvádza sa v Tabuľke 3. Tabuľka 3 Citlivosť cobas EGFR Mutation Test použitím DNA zmesí plazmidu a bunkovej línie EGFR Exon Mutácia EGFR Cielená sekvencia nukleovej kyseliny Najmenšie množstvo DNA (ng) v člene panela s 5 % mutáciou na dosiahnutie 95 % pravdepodobnosti výsledku Mutation Detected (N = 72 replikátov) 18 G719A 2156 G>C 3,13 19 Exon 19 Delécia del15 0,78 20 S768I 2303 G>T 0,78 20 T790M 2369 C>T 3,13 20 Exon 20 Vloženie 2307_2308ins9 (GCCAGCGTG) 3,13 21 L858R 2573 T>G 0, SK 15 Doc Rev. 1.0

16 Analytická citlivosť použitím zmesi vzoriek FFPET Tri extrakty vzoriek FFPET DNA pre mutácie delécia Exon 19 a L858R boli zmiešané s extraktmi zo vzorky FFPET štandardného EGFR na získanie zmesí so vzorkami na 10, 5,0, 2,5 a 1,25 % úroveň cielenej mutácie stanovenú validovanou masívne paralelnou pyrosekvencovacou metódou, sekvencovaním 454 (454 Life Sciences, Branford, CT, USA). Boli pripravené sériové nariedenia každej zmesi vzoriek a osem (8) replikátov každého člena panela bolo testovaných v cykle použitím každej z 3 šarží cobas EGFR Mutation Test (n=24/člena panela). Citlivosť každej vzorky bola stanovená najnižším množstvom DNA, ktoré prinášalo EGFR Mutation Detected s pravdepodobnosťou najmenej 95 % pre cielenú mutáciu, uvedenú v tabuľke 4. Tabuľka 4 Citlivosť cobas EGFR Mutation Test použitím zmesí vzorky FFPET Mutácia EGFR Exon 19 Delécia L858R Percento mutácie v člene panela na dosiahnutie 95 % pravdepodobnosti Mutation Detected (mutácia zistená) pri vstupnom množstve DNA 50 ng Vzorka Sekvencia nukleovej kyseliny EGFR na jednu reakčnú jamku (N = 24 replikátov) Vzorka č _2249del15 1,4 Vzorka č _2250del15 2,5 Vzorka č _2252del15 2,4 Vzorka č T>G 4,0 Vzorka č T>G 4,2 Vzorka č T>G 4,3 Táto štúdia ukazuje, že cobas EGFR Mutation Test dokáže detegovať mutácie v exonoch 19 a 21 EGFR pri úrovni mutácie minimálne 5 % použitím štandardného vstupného množstva 50 ng na jednu reakčnú jamku. Korelácia s referenčnou metódou Bolo uskutočnené porovnávacie testovanie 201 vzoriek NSCLC FFPET každej z 2 šarží cobas EGFR Mutation Test a 2X obojsmerného sekvencovania (Sanger) na stanovenie percenta pozitívnych, negatívnych a celkovej zhody výsledkov medzi oboma metódami. Nesúhlasné výsledky medzi cobas EGFR Mutation Test a Sangerom boli testované pomocou sekvencovania 454, aby sa nesúhlas vyriešil. Vzorky s neplatnými výsledkami z cobas EGFR Mutation Test alebo Sanger boli z analýzy vylúčené. Výsledky cobas EGFR Mutation Test sa považujú za neplatné, ak boli niektoré alebo všetky signály mutácie hlásené ako neplatné (Tabuľka 2). Výsledky Sanger sú považované za neplatné, ak niektoré alebo všetky štyri exony na vzorke nedali platné výsledky. Výsledky cobas EGFR Mutation Test a Sanger Z 201 vzoriek hodnotených pri porovnaní 49 vzoriek nemohlo byť hodnotených z hľadiska zhody, pretože obe metódy dávali neplatné výsledky. 48 vzoriek bolo neplatných pre Sanger (23,8 %), 6 vzoriek bolo neplatných pre cobas EGFR Mutation Test Šarža 1 (3,0 %) a 5 vzoriek bolo neplatných pre cobas EGFR Mutation Test Šarža 2 (2,5 %). Distribúcia neplatných výsledkov v každej z metód je uvedená v tabuľke 5. Tabuľka 5 Rozdelenie neplatných výsledkov medzi metódami cobas EGFR Mutation Test Neplatné vzorky podľa metódy Šarža 1 Šarža 2 Neplatný iba Sanger Neplatný iba cobas 1 1 Neplatný Sanger a cobas 5 4 Celkom SK 16 Doc Rev. 1.0