S. Hribar, A. Rauter, J. Štrancar, Z. Pavlica, M. Petelin

Transcription

1 petelin4 KOR.qxd :45 Page 3 Zobozdrav Vestn 2009; 64: UREDITEV HIDROKSIAPATITNIH KRISTALOV V DENTINU Arrangement of hydroxyapatite crystals in dentine Ključne besede: dentin, ureditev hidroksiapatitnih kristalov, elektronska paramagnetna resonanca (EPR), simulacije kotno odvisnih spektrov Key words: dentine, arrangement of hydroxyapatite crystals, electron paramagnetic resonance (EPR), simulation of angular dependent spectra Izvleček Izhodišče: Dentin tvori osnovo zoba. Je trdo elastično tkivo, ki varuje pulpino votlino. Poznavanje urejenosti hidroksiapatitnih kristalov (HA) je pomembno za razumevanje mehanskih lastnosti dentina in razvoja zobne gnilobe. Materiali in metode: Vzorci dentina velikosti 1,5 x 3 x 4 mm so bili izrezani iz desetih človeških zgornjih prvih sekalcev, izdrtih zaradi brezupne napovedi izida zdravljenja parodontalne bolezni. Pripravljen je bil tudi dentinski prah. Vzorci in dentinski prah so bili obsevani pri sobni temperaturi, na zraku z žarki gama Co 60 do končnega odmerka 5 μgy. Nato so bili posneti njihovi EPR-spektri pri različnih orientacijah glede na magnetno polje. Iz primerjave med izmerjenimi in izračunanimi spektri na osnovi na novo razvitega modeliranja spektrov je bila določena najbolj verjetna sestava dentina z vidika urejenosti kristalov HA in dentinskih kanalčkov. Rezultati: Delež enako usmerjenih kristalov HA v dentinu je bil 5,6 ± 0,7 %, ostali kristali so naključno razporejeni. Enako usmerjeni kristali HA tvorijo znotrajtubulni dentin in so s svojo daljšo osjo usmerjeni pravokotno na os dentinskih kanalčkov. Naklon dentinskih kanalčkov glede na vertikalno os skozi središče zobne korenine je za koreninski dentin zgornjih srednjih sekalcev znašal 24,3 o ± 2 o. Zaključki: Na osnovi analiz iz literature ter naših rezultatov sklepamo, da urejenost kolagensko-mineralnega kompleksa določa mehanske lastnosti dentina in vpliva na potek zobne gnilobe. Abstract Background: Dentine forms the bulk of the tooth. It is a hard elastic tissue that protects the pulp chamber. Knowledge of the arrangement of hydroxyapatite (HA) crystals is important for understanding the mechanical properties of dentine and the progression of tooth decay. Materials and methods: Dentine samples (1.5 x 3 x 4 mm) and dentine powder were prepared from 10 human upper first incisors extracted because of advanced periodontal disease. The samples and the powder were irradiated with Co 60 gamma rays at room temperature in the presence of air to a final dose of 5 μgy. EPR spectra were measured at different orientations relative to the magnetic field. The arrangement of HA crystals and dentinal tubules was studied by comparing the measured spectra with those obtained by a new simulation method. Results: The proportion of aligned HA crystals in dentine amounted to 5.6 ± 0.7 per cent; other crystals had random orientation. The aligned crystals formed intratubular dentine, their longer axes lay perpendicular to the axes of dentinal tubules. In root dentine, the slope of the tubules, determined with reference to the vertical axis passing through the root centre, amounted to 24.3 o ± 2 degrees. Conclusion: On the basis of data from the literature and our results, we conclude that the arrangement of HA crystals and the collagen fibril network determine the mechanical properties of dentine and the progression of tooth decay.

2 petelin4 KOR.qxd :45 Page 4 4 Uvod Dentin tvori osnovo zoba. Je trdo, a hkrati tudi elastično tkivo, ki varuje pulpino votlino. Sklenina je sicer trša od dentina, vendar je krhka, zato je elastičnost dentina pomembna pri prenosu griznih sil. Dentin je po celi debelini prepreden s številnimi kanalčki (dentinskimi tubuli), ki vsebujejo celične podaljške odontoblastov in tkivno tekočino. Oblika dentinskih kanalčkov posnema podolgovato obliko črke 'S' in kaže pot, ki jo je odontoblast opravil med dentinogenezo. Anorganski del dentina predstavljajo hidroksiapatitni kristali (HA), organski del pa predvsem kolagenska vlakna (Ten Cate, 1998), ki med dentinskimi kanalčki oblikujejo mrežasto strukturo. V ozkem pasu okrog dentinskih kanalčkov potekajo kolagenska vlakna pravokotno na njihovo os (Lertchirakarn in sod., 2001). Pregled z elektronskim mikroskopom je pokazal, da vzdolžna os kristalov leži vzporedno z osjo kolagenskih vlaken (Selvig, 1963). Ureditev kristalov HA v dentinu podrobneje še ni bila raziskana. Elektronska paramagnetna resonanca (EPR) se je izkazala kot zelo učinkovita spektroskopska metoda za določanje stopnje urejenosti kristalov v obsevani sklenini (Cevc in sod., 1980), koreninskem cementu (Skalerič in sod., 1998) in kosti (Doi in sod., 1979), saj se spektri različno usmerjenih kristalov med seboj precej razlikujejo. Da bi ugotovili ureditev kristalov HA v dentinu, smo s pomočjo spektroskopije EPR preučili dentinske vzorce. Glede na značilno histološko sliko dentina in potek kolagenskih vlaken smo predpostavili, da je delež enako usmerjenih dentinskih kristalov nizek, večina jih je razporejena naključno. Želeli smo ugotoviti, kolikšen je ta delež v celotnem dentinu in pod kakšnim kotom so kristali postavljeni glede na dentinske kanalčke. Poznavanje ureditve kristalov v dentinu je pomembno pri ugotavljanju mehanskih lastnosti tkiva in razumevanju napredovanja zobne gnilobe. Materiali in metode V raziskavi smo uporabili 10 človeških stalnih zgornjih prvih sekalcev, ki so bili izdrti zaradi napredovale parodontalne bolezni. Zobje niso imeli zobne gnilobe. Pacienti so bili obeh spolov, njihova starost je bila od 45 do 58 let, povprečna starost je bila 52,2 let. Priprava vzorcev in obsevanje Vzorce dentina smo izrezali s turbinskim kolenčnikom (Kavo Mondial, Germany) z rotacijsko hitrostjo obratov/min (Super-Torque, 630 B, Kavo, Germany) in drobnozrnatim diamantnim svedrom, hlajenim z vodnim sprejem. Debelina dentinskih vzorcev je bila 1,5 mm, širina 3 mm ter višina 4 mm. Vzorci so bili izrezani na lični strani zobne korenine pod skleninsko-cementno mejo, v razdalji 2 mm od vertikalne osi koreninskega kanala (Slika 1). Dentinski kanalčki so v tem predelu najbolj ravni, kar je olajšalo obdelavo in razlago eksperimentalnih podatkov. Vzorce smo označili tako, da smo lahko pozneje med merjenjem določili ploskev, obrnjeno proti površini zobne korenine, in tisto stran vzorca, ki je bila obrnjena proti zobni kroni. Slika 1: Shematska slika zoba prikazuje mesto izreza dentinskega vzorca. Označene so dve osi vzorca (X, Z) in 2-milimetrska oddaljenost notranje površine vzorca od vertikalne osi koreninskega kanala. Vzorce smo obsevali pri sobni temperaturi na zraku z žarki gama Co 60 do končnega odmerka 5 μgy. Posledica obsevanja je nastanek dveh zelo stabilnih paramagnetnih centrov, CO 2 - in 3 CO 3, katerih osi anizotropije magnetne sklopitve sta usmerjeni vzporedno z daljšo osjo kristala HA (Cevc in sod., 1980).

3 petelin4 KOR.qxd :45 Page 5 Ureditev hidroksiapatitnih kristalov v dentinu 5 Merjenje spektrov EPR Vsak vzorec smo na štiri različne načine pritrdili na teflonski nosilec (Slika 2), ki je bil povezan s pripravo za merjenje kotov (goniometer). Slika 2: Slika prikazuje različne načine pritrditve vzorca na teflonski nosilec. Vzorec smo tako vrteli okoli vseh treh osi: okoli osi Z (A), osi Y (B) in osi X (C) ter okoli ploskovne diagonale ploskve zy (D). Teflonski nosilec z vzorcem smo vstavili v spektrometer EPR (Bruker ESP 300). EPR je spektroskopska metoda, s katero preučujemo paramagnetne centre, tj. molekule (Štrancar, 2004), atome ali ione (Rotar, 2001), ki imajo v svoji strukturi nesparjene elektrone (s spinom) in zato magnetni moment. Ko postavimo takšno snov v magnetno polje in jo obsevamo z ustreznimi mikrovalovi, se magnetni momenti paramagnetnih centrov uredijo v skladu s svojim spinom (Štrancar, 2004). Ko je izpolnjen resonančni pogoj, lahko prehajajo iz enega v drug energijski nivo (Rotar, 2001). Energija prehoda ter relaksacijske lastnosti so odvisne od okolice, elektronskih lasnosti ter orientacije glede na magnetno polje. To lastnost smo izkoristili tudi pri naši raziskavi. Meritev smo opravili v naslednjih razmerah: center polja 329,2 mt, gostota magnetnega polja 10 mt, frekvenca mikrovalov 9,353 GHz in moč 10 mw, čas snemanja 21 s, 100-kiloherčna modulacija z amplitudo 0,1 mt in časovno konstanto filtriranja 21 ms. Vzorec smo s pomočjo goniometra vrteli okoli daljše osi teflonskega nosilca. Pri tem smo spreminjali kot, ki ga je vzorec oklepal z magnetnim poljem, v korakih po 9 o ; od 0 o (začetna postavitev vzorca) do 180 o. Pri eni postavitvi vzorca smo tako izmerili 21 spektrov. Skupno število izmerjenih spektrov za en vzorec je bilo 84. Pripravili smo tudi dentinski prah, ki nam je služil kot pokazatelj naključno razporejenih kristalov oz. v vseh smereh razporejenih kristalov HA. Dentinski vzorec smo zdrobili v terilniku in prah zbrali v stekleni kapilari s premerom 1 mm ter izmerili njegov spekter EPR. S primerjavo spektra dentinskega prahu s spektrom, ki smo ga dobili z računalniško simulacijo naključno razporejenih kristalov aksialno simetričnega centra, smo določili vrednosti g za paramagnetne centre v tkivu. Vsi spektri so bili shranjeni v digitalni obliki. Ureditev kristalov HA je bila ocenjena s primerjavo med izmerjenim in izračunanim spektrom za posamezen dentinski vzorec. Pri tem naj izpostavimo naslednje prednosti uporabe spektroskopije EPR: ker je signal EPR v dentinu kotno odvisen, lahko sledimo usmeritvi kristalov HA s pomočjo meritev kotne odvisnosti oblike signala EPR (Cevc in sod., 1976) na neinvaziven način (Zweier in Kuppusamy, 1994). Poleg tega pa nam za razliko od rentgenske analize in elektronskomikroskopske preiskave omogoča določitev ureditve kristalov v razmeroma velikem in debelem vzorcu trdih zobnih tkiv, zato ugotovitve lahko prenesemo na celotno debelino dentina s predpostavko, da je ureditev v vzorcu konstantna oz. da znamo morebitno kotno odvisnost določiti s pomočjo modeliranja. Rezultati Rezultati primerjave izmerjenih in računalniško izračunanih spektrov so pokazali, da znaša delež enako usmerjenih kristalov HA v dentinu 5,6 ± 0,7 %, ostali pa so naključno razporejeni. Enako usmerjeni kristali HA tvorijo znotrajtubulni dentin, s svojo daljšo osjo so usmerjeni pravokotno na os dentinskih kanalčkov, okoli katerih so radialno razporejeni (Slika 3). Določili smo naklon dentinskih kanalčkov glede na vertikalno os skozi središče zobne korenine, ki je znašal 24,3 o ± 2 o. Primerjava izmerjenih in računalniško izračunanih spektrov EPR je prikazana na primeru vzorca št. 3 na Sliki 4. Zaradi preglednosti smo iz množice spektrov izbrali le po dva spektra za vsako postavitev vzorca glede na tri osi. Smeri magnetnega polja so označene nad posameznimi spektri v koordinatnem sistemu vzorca. Pri ostalih vzorcih so bili izmerjeni spektri EPR enaki v okviru šuma. Ob parametrih: naklon dentinskih kanalčkov glede na vzdolžno os skozi središče zobne korenine 23,9 o, odklon kristalov glede na smer dentinskih kanalčkov 90,4 o in 5,8-odstotni delež enako usmerjenih kristalov smo dobili najboljšo primerjavo spektrov.

4 petelin4 KOR.qxd :45 Page 6 6 Razpravljanje Slika 3: Shematski prikaz ureditve kristalov HA v dentinskem vzorcu. Prikazana stran je obrnjena proti zobni pulpi. V znotrajtubulnem dentinu okoli dentinskih kanalčkov (D) so kristali radialno usmerjeni, v intertubularnem dentinu (T) pa so razporejeni naključno. Predstavljene so osi vzorca (X, Y, Z) in kot, ki ga oklepajo dentinski kanalčki glede na vzdolžno os skozi središče zobne korenine (j). Os X je pravokotna na vzdolžno os skozi središče korenine, os Y je vzporedna s površino korenine in os Z je vzporedna z vzdolžno osjo skozi središče zobne korenine. Slika 4: Primerjava izmerjenih (polna črta) in izračunanih (prekinjena črta) spektrov EPR 3-kotnih odvisnosti postavitve dentinskega vzorca. Izračunani spektri EPR ustrezajo strukturiranosti in geometrijam vzorca. Parametri za izračun so bili: naklon dentinskih kanalčkov glede na vzdolžno os skozi središče zobne korenine 23,9 ; odklon kristalov glede na smer dentinskih kanalčkov 90,4 in delež enako usmerjenih kristalov 5,8 %. Vpliv urejenosti dentinskih kristalov na mehanske lastnosti zoba Dentinski kanalčki so cilindrične strukture, ki potekajo od skleninsko-dentinske ali dentinskocementne meje proti zobni pulpi in se na svoji poti drug drugemu približujejo (Bouillaguet, 2004). Okrog zobne pulpe so razporejeni radialno, v pulpi izstopajo nižje oz. bližje konici korenine kakor na površini dentina in glede na vzdolžno os korenine potekajo pod določenim kotom (Gašperšič in Jan, 2003). Tak potek potrjuje tudi naša raziskava, saj smo ugotovili, da znaša kot, ki ga kanalček v zobni korenini oklepa z vzdolžno osjo zoba, približno 24 o. V zadnjem času mnogi avtorji menijo, da intertubularni dentinski matriks določa elastične lastnosti dentina. Urejenost kolagenskomineralnega kompleksa naj bi bila pri tem odločilni dejavnik, dentinski kanalčki pa naj ne bi povzročali elastične anizotropije (Kinney in sod., 2001). Zaradi specifičnega poteka dentinskih kanalčkov menimo, da ni povsem tako. Dentinski kanalčki bi lahko ob obremenitvi zoba delovali kot blažilnik sile. Lahko si jih predstavljamo kot cevi, napolnjene s tekočino. Preprost blažilnik sile je sestavljen iz zaprtega valja in bata z odprtino, ki se giblje znotraj valja. Bat razdeli valj na dva dela, ki sta napolnjena s tekočino (Surace in sod., 2004). Podobno si lahko predstavljamo v primeru dentinskega kanalčka, le da se namesto z batom prostornina kanala spreminja z upogibom njegove stene. Močan pritisk na dentin naj bi v trenutku potisnil vsebino dentinskega kanalčka ob oviro in tako zmanjšal pretok tekočine (Camps in sod., 1997). Pri tem pa so pomembne lastnosti stene kanalčka, ki je odvisna od usmeritve dentinskih kristalov. To domnevo potrjuje ugotovitev, da je upogibna trdnost dentina v smeri, pravokotno na potek dentinskih kanalčkov, značilno nižja kakor vzporedno z njimi (Arola in Reprogel, 2006). To ugotovitev si lahko razlagamo s tem, da je stena kanala pri takšni razporeditvi razdeljena na več med seboj povezanih delov. Ob obremenitvi intertubularnega dentina se le-ta razširi v smeri, kjer nanj ne deluje sila. V primeru obremenitve v osi zoba to pomeni, da se intertubularni dentin izboči v smeri volumna dentinskega kanalčka.

5 petelin4 KOR.qxd :45 Page 7 Ureditev hidroksiapatitnih kristalov v dentinu 7 Dentinski kanalčki poleg tega razdelijo dentin tudi na več manjših področij, saj prepredajo celoten dentin. Dokazano je, da zavzemajo približno 10 % njegove prostornine (Lertchirakarn in sod., 2001). Ko se znotraj dentinskega kanalčka zviša tlak, se sila porazdeli po vsej površini dentinskega kanalčka in posledično absorbira po vsem dentinu, ki leži ob kanalčku. Ureditev kristalov je pomembna tudi pri lomni lastnosti dentina. Ugotovljeno je bilo namreč, da se dentin zlomi vzporedno z osjo dentinskega kanalčka šele pri večjih silah, kakor če sila deluje pravokotno na os kanalčka (Kinney in sod., 2003). To je verjetno povezano z usmeritvijo dentinskih kristalov, ki so s svojo daljšo osjo postavljeni pravokotno na vzdolžno os kanalčka. Enako so usmerjena tudi kolagenska vlakna (Lertchirakarn in sod., 2001). Iz tega sledi, da je v smeri, pravokotno na os kanalčka, mogoče najti več špranj, kjer kristala ne lomimo, ampak ga le ločujemo od drugega kristala oz. kolagenskega vlakna. Pri prelomu, ki bi potekal vzdolž dentinskega kanalčka, pa bi morali poleg dentinskega kristala prelomiti oz. pretrgati tudi kolagensko vlakno. Vloga urejenosti dentinskih kristalov pri napredovanju zobne gnilobe Pri širjenju zobne gnilobe kisline, ki jih tvorijo bakterije, raztapljajo anorganski del trdih zobnih tkiv. Raztapljanje se pojavi, ko ph v zobnem plaku pade pod 5,5 (Tjäderhane in sod., 1998). Dokazana je bila pomembnost usmeritve skleninskih kristalov glede na delovanje kislin oz. začetek zobne gnilobe. Vrhnji sloj, imenovan tudi brezprizmatski, kjer ležijo skleninski kristali s svojo daljšo osjo skoraj pravokotno na površino sklenine, je odpornejši na kislinsko delovanje kakor preostali del. Najvišjo stopnjo urejenosti so našli v zunanjem, 50 μm debelem sloju sklenine, ki ščiti sklenino pred napredovanjem zobne gnilobe. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da ima zdrava sklenina v primerjavi s kariozno večjo stopnjo urejenosti kristalov (Cevc in sod., 1976; Cevc in sod., 1980). Velja poudariti podobnost v urejenosti dentinskih kristalov znotrajtubulnega dentina in skleninskih kristalov ob njeni površini. Predvidevamo, da je visoka stopnja urejenosti kristalov v znotrajtubulnem dentinu pomemben dejavnik, ki upočasnjuje lateralno širjenje zobne gnilobe. Ugotovili smo, da so kristali HA znotrajtubulnega dentina radialno razporejeni okoli dentinskega kanalčka in s svojo daljšo osjo postavljeni pravokotno na njegovo os. Ob takšni ureditvi dentinskih kristalov je z vidika lateralnega širjenja zobne gnilobe, kislinskemu delovanju izpostavljena najmanjša ploskev kristala. Kristal se sicer hitreje raztaplja v smeri daljše osi, vendar raztapljanje povzroči poškodbo majhnega osrednjega dela kristala HA. Iz raziskav, ki so bile narejene na sklenini, je znano, da se kristalno jedro hitro raztopi, medtem ko preostala lupina ostane nepoškodovana dalj časa (Simmelink in Abrigo, 1989). Pomembnost znotrajtubulnega dentina pri lateralnem širjenju zobne gnilobe potrjuje tudi značilen potek napredovanja zobne gnilobe v dentinu. Zobna gniloba se na skleninsko-dentinski meji razširi, saj se dentin raztaplja hitreje kot sklenina. Ko zobna gniloba napreduje proti pulpi, sledi poteku dentinskih kanalčkov (Thylstrup in Fejerskov, 1999), ki se na poti proti pulpi drug drugemu približujejo (Bouillaguet, 2004). To je pomembno, saj se na ta način količina dentina, ki ga je prizadela zobna gniloba, proti pulpi zmanjšuje, kar potrjuje zaščitno vlogo znotrajtubulnega dentina, ki omejuje lateralno širjenje zobne gnilobe. Reference Arola DD, Reprogel RK. Tubule orientation and the fatigue strength of human dentin. Biomaterials 2006; 27: Bouillaguet S. Biological risks of resin-based materials to the dentin-pulp complex. Crit Rev Oral Biol Med 2004; 15: Camps J, Giustiniani S, Dejou J, Franquin JC. Low versus high pressure for in vitro determination of hydraulic conductance of human dentine. Arch Oral Biol 1997; 42: Cevc P, Schara M, Ravnik Č, Skalerič U. Study of the arrangement of crystallites in gamma-irradiated human enamel by electron paramagnetic resonance. J Dent Res 1976; 55: Cevc G, Cevc P, Schara M, Skalerič U. The caries resistance of human teeth is determined by the spatial arrangement of hydroxyapatite microcrystals in enamel. Nature 1980; 286: Doi Y, Aoba T, Okazaki M, Takahashi J, Moriwaki Y. Analysis of paramagnetic centers in x-ray-irradiated enamel, bone and carbonate-containing hydroxyapatite by electron spin resonance spectroscopy. Calcif Tissue Int 1979; 28: Gašperšič D, Jan J. Histologija zobnega organa. 3 rd ed. Ljubljana: Medicinska fakulteta; 2003.

6 petelin4 KOR.qxd :45 Page 8 8 Kinney JH, Pople JA, Marshall GW, Marshall SJ. Collagen orientation and crystallite size in human dentin: a small angle x-ray scattering study. Calcif Tissue Int 2001; 69: Kinney JH, Marshall SJ, Marshall GW. The mechanical properties of human dentin: a critical review and reevaluation of the dental literature. Crit Rev Oral Biol Med 2003; 14: Lertchirakarn V, Palamara JEA, Messer HH. Anisotropy of tensile strength of root dentin. J Dent Res 2001; 80: Rotar T. Vpliv resorpcije korenin mlečnih zob in devitalizacije stalnih zob na difuzijske procese v zobni sklenini [magistrsko delo]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; Selvig KA. Electron microscopy of Hertwig's epithelial sheath and of early dentin and cementum formation in the mouse incisor. Acta Odont Scand 1963; 21: Simmelink JW, Abrigo SC. Crystal morphology and decalcification patterns compared in rat and human enamel and synthetic hydroxyapatite. Adv Dent Res 1989; 3: Skalerič U, Cevc P, Gašpirc B, Schara M. Crystallite arrangement of hydroxyapatite microcrystals in human tooth cementum as revealed by electron paramagnetic resonance (EPR). Eur J Oral Sci 1998; 106: Surace C, Worden K, Tomlinson GR. An improved nonlinear model for an automotive shock absorber. Nonlinear Dynamics 2004; 3: Štrancar J. Electron paramagnetic resonance (EPR). In: Billet H, Draghici C, Coman G. Analytical biotechnology, principles and applications. Univ. Transilvania Brasov; p Ten Cate AR. Oral Histology: Development, Structure, and Function. 5 th ed. Missouri: Mosby-Year Book, Inc; Thylstrup A, Fejerskov O. Textbook of Clinical Cariology. 2 nd ed. Copenhagen: Munksgaard; Tjäderhane L, Larjava H, Sorsa T, Uitto VJ, Larmas M, Salo T. The activation and function of host matrix metalloproteinases in dentin matrix breakdown in caries lesions. J Dent Res 1998; 77: Zweier JL, Kuppusamy P. In vivo EPR spectroscopy of free radicals in the heart. Environ Health Perspect 1994; 102: Sašo Hribar in Anja Rauter, absolventa dentalne medicine, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani; doc. dr. Janez Štrancar, dipl. ing. fiz., Center za fiziko trdne snovi, Inštitut Jožef Stefan, Ljubljana; prof. dr. Zlatko Pavlica, dr. vet. med., Klinika za kirurgijo in male živali, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani; prof. dr. Milan Petelin, dr. stom., Katedra za ustne bolezni in parodontologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani