Funkcije proteinov, pogojene s strukturo

Transcription

1 Funkcije proteinov, pogojene s strukturo Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni proteini: keratini, kolagen) Kontraktilni proteini Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko membrane Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze...) Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

2 Glavne lastnosti prenosa signala Specifičnost Adaptacija Ojačanje Združevanje (integracija) Lehninger, 2008

3 Prenos signala s hormoni Vodotopni (npr. peptidni) hormoni ne morejo v celico receptorji na membrani. lipidotopni vodotopni Lipidotopni (npr. steroidi) lahko pridejo v celico receptorji v citoplazmi (in na membrani).? R R učinek učinek Hormoni, ki neposredno aktivirajo encime, delujejo hitro. Hormoni, ki aktivirajo sintezo proteinov, pa se v jedru vežejo na DNA in delujejo počasi. učinek

4 Evkariontske celice: 6 vrst mehanizmov prenosa signala (Lehninger 2005) 1. ionski kanalčki z zaporo 2. membranski receptorski encimi 3. membranski receptorji, povezani z G proteini 4. jedrni receptorji, ki vežejo steroidne hormone, tiroidne hormone in vitamin D 5. membranski receptorji, ki privlačijo in aktivirajo topne proteine (proteinske kinaze) citoplazme 6. adhezijski receptorji, ki posredujejo informacijo med ekstracelul. matriksom in citoskeletom

5 Evkariontske celice: 6 vrst mehanizmov prenosa signala (Lehninger 2008) 1. membranski receptorji, povezani z G proteini 2. membranski receptorski encimi - receptorji tirozinskih kinaz (insulinski receptor) 3. receptorji gvanilatnih ciklaz 4. ionski kanalčki z zaporo 5. jedrni receptorji, ki vežejo steroidne hormone, tiroidne hormone in vitamin D 6. adhezijski receptorji, ki posredujejo informacijo med ekstracelul. matriksom in citoskeletom Lehninger, 2008

6 Receptorji gvanilatnih ciklaz in cgmp signalizacija -Sekundarni obveščevalec je cgmp; -Aktivacija s cgmp-odvisno protein kinazo; - fosforilacija encimskih tarč; ANF receptor (atrial natriutretic factor) gvanilinski in endotoksinski receptor Gvanilat ciklaza cgmp Sekundarni obveščevalec Fosfodiesteraza (PDE) 5 -GMP nekativen z NO aktivirana gvanilatna ciklaza (topna!!) Medicinska uporaba: - NO spodbudi relaksacijo srčne mišice (angina pektoris) - Viagra inhibira fosfodiesterazo krvnih žil penisa: koncentracija cgmp ostane povišana

7 Evkariontske celice: 6 vrst mehanizmov prenosa signala (Lehninger 2008) 1. Membranski receptorji, povezani z G proteini 2. Membranski receptorski encimi - receptorji tirozinskih kinaz (insulinski receptor) 3. Receptorji gvanilatnih ciklaz 4. Ionski kanalčki z zaporo 5. Jedrni receptorji, ki vežejo steroidne hormone, tiroidne hormone in vitamin D 6. Adhezijski receptorji, ki posredujejo informacijo med ekstracelul. matriksom in citoskeletom Lehninger, 2008

8 Signaliziranje preko jedrnih receptorjev - Lipidotopni hormon sproži biološki odgovor v odzivnih tkivih, ki vsebujejo jedrne receptorje za hormon - Hormon se veže na receptor z visoko afiniteto (K d 10-9 M) in specifičnostjo v kompleks hormon-receptor H + R = H-R AR ER PR GR MR TR - Ob vezavi hormona se receptor konformacijsko spremeni, odkrije se vezavno mesto za DNA, kompleks se veže na specifična mesta na DNA in s tem uravnava (aktivira) prepisovanje določenih genov; s hormonom aktivirani receptor deluje kot transkripcijski faktor, RNA-polimeraza sintetizira mrna - Informacija se prenese do ribosomov, kjer se sintetizira določen protein kot odgovor na signal - hormon VDR RAR, RXR Vsaka skupina lipidotopnih hormonov ima svojo vrsto receptorjev!!

9 Jedrni receptorji, ki vežejo steroidne in tiroidne hormone, vitamin D, retinoide enak mehanizem delovanja Primer delovanja estrogenskega receptorja

10 Jedrni receptorji so DNA vezavni proteini, ki vsebujejo Zn prste Cys-X(2)-Cys-(X13)- Cys-(X2)- Cys Ligand (kortikosteron) sproži prehod MR v jedro Ligand (estradiol) sproži prehod ER v jedro in vezavo na promotorske regije tarčnih genov

11 Uravnavanje izražanja genov s steroidnimi in tiroidnimi hormoni, retinoidi in vitaminom D Lehninger 2008

12 Motnje v biosignaliziranju: onkogeneza Pretvorba protoonkogenov v onkogene Znani so onkogeni, ki kodirajo Virusna infekcija Prerazporeditev kromosomov Kemične učinkovine UV sevanje Mutacija, ki privede do onkogenov je genetsko dominantna Rakave celice Rastne faktorje Membranske proteine - receptorje za rastne faktorje Citoplazemske proteine - G proteine (Ras) - Proteinske kinaze - Jedrne transkripcijske faktorje, ki so ključnega pomena za delitev celice (Jun, Fos) Povišana hitrost mitoze Izguba diferenciacije Rakava celica ne prepozna normalnih omejitev razraščanje Razseje se po organizmu metastaze Ne odziva se na normalne mitotske stimuluse Je nesmrtna ni podvržena normalnemu staranju celic in apoptozi Maligna rast je lahko dedna spremembe v celičnem genomu

13 Motnje v biosignaliziranju: izražanje onkogenov Onkogeni so mutirane oblike genov, ki kodirajo proteine celičnega cikla missinglink.ucsf.edu/lm/cell

14 Estrogeni stimulirajo delitev celic Mutacija v genu, ki uravnava rast in delitev celic rakasta rast

15 Struktura antagonistov estrogenov Tamoksifen, antagonist estrogenov, se uporablja pri zdravljenju raka dojke A cluster of breast cancer cells showing visual evidence of programmed cell death in yellow Photo: ANNIE CAVANAGH Breast cancer superdrug could soon be even better after secrets unlocked 12 Nov 2008 (Telegraph, UK) A cancer superdrug which is used to treat thousands of women with breast cancer could soon be made even more effective after scientists unlocked the secret of its power. Researchers have identified for the first time the "chemical mechanism" by which tamoxifen works on tumour cells and the vital gene that has to be inactivated for a successful outcome. Tamoxifen is given to most women for five years after they are first diagnosed with breast cancer to help prevent it from returning. But some patients develop resistance to the drug.

16 Funkcije proteinov, pogojene s strukturo Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Oporna funkcija (strukturni proteini: keratini, kolagen) Kontraktilni proteini Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko membrane Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze...) Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

17 Encimi Splošne strukturne in biokemijske lastnosti Specifičnost delovanja Encimska aktivnost. Izoencimi Prostetične skupine. Mehanizem encimske katalize (teorija prehodnega stanja) Kislinsko-bazična kataliza, kovalentna kataliza, kataliza s kovinskimi ioni Klasifikacija encimov Encimska kinetika Encimska inhibicija Uravnavanje biokemijskih reakcij Encimi v medicinski diagnostiki Encimi v biotehnologiji in sinteza zdravil

18 Splošne lastnosti encimov Encimi so visokospecializirani proteini (ali RNA!!) - velika katalitična moč - velika specifičnost Encimi biokatalizatorji omogočajo reakcije v blagih razmerah temperatura, ph, tlak) - primer razgradnja saharoze, vaje (1,5 in 2,5 M HCl) Delujejo organizirano katalizirajo reakcijska zaporedja po stopnjah, npr. razgradnja hranilnih molekul in shranjevanje / transformacija energije biosinteze makromolekul,... Bolezenske spremembe - spremenjena encimska aktivnost (znižana, zvišana) diagnostika, terapija Uporaba encimov: v medicini, v farmacevtski in živilski industriji, v agronomiji...

19 Reakcije vseh metaboličnih poti katalizirajo encimi

20 Zgodovina encimov V 18. stoletju raziskave razgradnje mesa z izločki želodca V 19. stoletju razgradnja sladkorja s slino in rastlinskimi izvlečki 1850 Luis Pasteur: kvasovke fermentirajo sladkor alkohol: fermenti v živih celicah (vitalizem) 1897 Eduard Buchner: izvlečki iz kvasovk fermentirajo sladkor aklohol: aktivne molekule - encimi 1926 James Sumner: encim ureaza je protein 1930 J.B.S. Haldane: katalitično moč encimov pogojujejo šibke interakcije med encimom in substratom

21 Kako encimi delujejo? Nekatalizirana kemijska reakcija S P substrat produkt Encimsko katalizirana kemijska reakcija E + S ES EP E + P E encim S substrat, P produkt ES kompleks encim-substrat EP kompleks encim-produkt

22 Substrat, vezan na (v) aktivno mesto encima Encim predstavlja za molekule, ki reagirajo (substrate), specifično okolje, reakcija poteče na aktivnem mestu encima

23 Potek encimsko katalizirane reakcije S P nekatalizirana reakcija katalizirana reakcija S P E + S ES EP E + P ΔG 0 sprememba standardne proste energije pri prehodu S P ΔG # S P energijska bariera za prehod S # (prehodno stanje) ΔG # P S energijska bariera za prehod P # (prehodno stanje) ΔG 0 nekatalizirana = ΔG0 katalizirana katalizator ne vpliva na ravnotežje!!! ES, EP intermediata katalizirane reakcije ΔG # cat energijska bariera katalizirane reakcije

24 Ravnotežna konstanta K ravn (K eq ) in sprememba standardne proste entalpije ΔG o Encim je katalizator, zato ne spreminja ravnotežja reakcije! Reakcija, ki spontano ne poteka od reaktantov do produktov, tudi v prisotnosti encima ne bo potekala v to smer. V prisotnosti encima ne moremo dobiti nič več produktov kot jih lahko dobimo brez encima. SPREMENI SE SAMO HITROST! S P ΔG o = - RT ln K

25 Hitrost (v) reakcije S P določa hitrostna konstanta k, to pa ΔG S P v = k [S] S 1 + S 2 P v = k [S 1 ] [S 2 ] k k Boltzmannova konstanta (n.r/n A ; n = št. molov, R = plinska konstanta, N A = Avogadrova konstanta) h Planckova konstanta ΔG aktivacijska energija (aktivacijska prosta entalpija) R, T konstanti

26 Primerjava nekatalizirane in katalizirane reakcije Nekatalizirana reakcija S P K = Ravnotežje Večja aktivacijska energija Manjša reakcijska hitrost Reakcijski mehanizem preko prehodnega stanja P S Katalizirana z encimom E + S ES EP E + P K = Ravnotežje Manjša aktivacijska energija Večja reakcijska hitrost Reakcijski mehanizem preko drugih reakcijskih intermediatov in prehodnih stanj P S Aktivacijska energija ΔG # določa hitrost reakcije Katalizatorji pospešijo hitrost reakcije (znižajo aktivacijsko energijo), ne spremenijo pa ravnotežja reakcije!

27 S P E + S ES EP E + P ΔG o = ΔG o = - RT ln K ΔG # < ΔG # v > v E + S ES ES 1 ES 2 EP E + P če je reakcija sestavljena iz zaporedja več reakcij, hitrost celotne reakcije določa najpočasnejša stopnja (največja aktivacijska energija) rate limiting step energijske bariere so ključnega pomena za življenje če jih ne bi bilo, bi se makromolekule spontano razgrajevale v osnovne gradnike... med evolucijo (zelo dolg čas!) so se razvili encimi, ki selektivno znižujejo aktivacijsko bariero

28 Zvišanje reakcijske hitrosti z encimi katalitična moč encimov

29 K energijski barieri ΔG # prispeva: Zmanjšanje entropije - manjša svoboda gibanja dveh molekul v raztopini Hidratacijski plašč vode obdaja biomolekule in jih stabilizira Deformiranje ( prelom ) substrata v reakciji Potreba po pravilnem prileganju katalitičnih funkcionalnih skupin encima s substratom Od kod energija za znižanje energijske bariere? 1. Sproščena prosta entalpija zaradi tvorbe šibkih vezi med interakcijo encima in substrata. 2. Šibke interakcij se med prehodom v prehodno stanje optimizirajo; aktivno mesto encima ni komplementarno substratu, temveč PREHODNEMU STANJU, čez katerega substrat preide na prehodu v produkte

30 ES - komplementarnost substrata z vezavnim mestom na encimu: šibke interakcije so optimizirane v prehodnem stanju Emil Fischer 1894 E in S - ključ v ključavnico Inducirano prilagajanje encima substratu in substrata encimu Encim je komplementaren reakcijskemu prehodnemu stanju Primer: encim dihidrofolatna reduktaza; NADP+ (rdeče) in tetrahidrofolat (rumeno) sta substrata. Aktivacijska energija se zniža zaradi sproščene vezavne energije ob nastanku šibkih interakcij med encimom in substratom

31 Imaginarni encim, ki katalizira prelom kovinske palice S S P ključ -ključavnica inducirano prilagajanje E in S

32 Vezavna energija prispeva h katalizi in k specifičnosti Šibke interakcije 4-30 kj/mol Znižanje ΔG # za kj/mol Maksimalno št. interakcij med encimon in substratom v prehodnem stanju (intermediatom) Skupine na encimu ustrezajo skupinam na substratu specifičnost!

33 Razgradnja (hidroliza) peptida z encimom peptidazo Peptidaza prime substrat (dipeptid) z najmanj tremi šibkimi vezmi, mu vsili novo konformacijo v kateri je peptidna vez že natrgana (prehodno stanje!) ENCIM VODA (S 2 ) SUBSTRAT (S 1 ) S 1 + S 2 P 1 + P 2

34 Encimi, kofaktorji, koencimi, prostetične skupine Encimi (biokatalizatorji) M r od do 10 6 Za aktivnost encima pomembna 3D struktura (primarna, sekundarna, terciarna, kvartarna) encimi - proteini (sestavljeni samo iz polipeptidne verige) katalitska funkcija - proteini + kofaktorji (ioni) katalitska funkcija - proteini + koencimi (kompleksne organske molekule) katalitska funkcija koencim ni stalno vezan na proteinski del prostetična skupina = koencim, trdno vezan na proteinski del molekule HOLOENCIM = APOENCIM + PROSTETIČNA SKUPINA encim proteinski del neproteinski del molekule

35 Kofaktorji in prostetične skupine encimov PREKURZOR (VITAMIN) tiamin (vitamin B1) riboflavin (vitamin B2) nikotinska kislina (niacin) pantotenska kislina in druge molekule piridoksin (vitamin B6) vitamin B12 biotin folna kislina lipojska kislina SKUPINA PRENOSA aldehidna skupina elektroni in protoni hidridni ion (H - ) acilne skupine amino skupine H-atomi in alkilne skupine CO 2 (-COOH) skupine z enim C- atomom elektroni in acilne skupine KOENCIM ALI PROSTETIČN A SKUPINA tiamin pirofosfat FMN, FAD NAD koencim A piridoksal fosfat (ciano)kobalam in biocitin tetrahidrofolna kislina lipojska kislina

36 + + Vitamini kot koencimi NAD, NADP H 2 + NAD + H NADH + H + 2 (prenos hidridnega iona)

37 Vitamini kot prostetične skupine FMN, FAD FAD + H FADH 2 2 (prenos 2 vodikovih atomov)