Zakaj izolirati encime? Namen izolacije. Splošni potek čiščenja proteinov. najprej razumeti njegovo delovanje v izoliranih sistemih

Transcription

1 Zakaj izolirati encime? najprej razumeti njegovo delovanje v izoliranih sistemih dodatki (kofaktorji, detergent) naučimo se o specifičnosti, kinetičnih lastnostih, regulaciji, strukturi predpogoj: čist encim amen izolacije pripraviti izolacijsko proceduro tako, da nam bo omogočila pridobiti encim z najboljšim izkoristkom encim mora pri tem imeti maksimalno katalitično aktivnost (brez razgradnih produktov ali neaktivnega encima) katalitična aktivnost proteina je določena s hitrostjo izginjanja S ali s hitrostjo nastajanja P, pod določenimi pogoji koncentracije S, T, p itn. enote aktivnosti: µmol S oz. µmol P v minuti (encimske enote po SI sistemu) mol S oz. mol P v sekundi (katal v SI sistemu) specifična aktivnost enote/mg oz. katal/kg doseči moramo maksimalno čistost Splošni potek čiščenja proteinov poiskati je potrebno tkivo, kjer se protein najbolje izraža tega je tam lahko le 0.01% od celokupne količine proteinov potrebna je homogenizacija, subcelična frakcionacija, ekstrakcija proteina, odstranitev netopnega materiala čiščenje do homogenosti vključuje več stopenj (kromatografije, elektroforeze)-ponavadi pri 4 0 C končni izkoristek mora biti vsaj nekaj % in od tega je lahko še delež, ki je neaktiven celoten proces poteče v nekaj dneh 1

2 izbira vira razširjenost encima ekstracelularna lokalizacija intracelularna lokalizacija membrane subcelularna lokalizacija encima samo ena lokacija (obdelamo celotno tkivo) na več lokacijah (separacija organelov) metode homogenizacije tkivo sesalcev tkivo je mehko, nežnejše metode homogenizacije (teflonski homogenizer) ekstrakcija z izotoničnimi raztopinami (lizosomi!) koktajl inhibitorjev rastline, gobe in bakterije rigidne stene celic (drobljenje z peskom ali steklenimi kroglicami, zamrzovanje-odtaljevanje) uporaba encimov (lizocim, hitinaza, glukanaza) vakuole pri rastlinah so bogate s proteoliznimi encimi fenolne spojine (oksidirajo encime) membransko vezani encimi zagotoviti primerno okolje-detergenti (anionski, kationski, neionski) 3 - -C - - denaturirajoči detergent (SDS) - - -C - nedenaturirajoči detergent (Triton, TDC, CAPS) mešan micel lipid-detergent denaturiran protein - C C C C solubiliziran protein nativni + mešan micel lipid-detergent 2

3 pufer in detergent priprava liposoma ultrazvok, 2 lipidi prazni liposom halobakterija bakteriorodopsin ATP-sintaza/bakteriorodopsin liposomi srce submitohondrijski delci ATP sintaza metode separacije lastnosti metoda velikost polarnost naboj centrifugiranje gelska filtracija dializa, ultrafiltracija ionsko-izmenjevalna kromatografija ionski izmenjevalci uporabni za izolacijo encimov anionski izmenjevalec kationski izmenjevalec C 2C 3 celuloza C 2 C 2 C 2C 3 DEAE-celuloza dietil aminoetil celuloza celuloza C 2 C CM-celuloza karboksimetil celuloza celuloza C 2 C 2 C 2C 3 C 2C 3 C 2 C celuloza P C 3 QAE-celuloza kvartarna amino etil celuloza fosfoceluloza 3

4 metode separacije lastnosti metoda velikost polarnost naboj topnost specifičnost hidrofobnost centrifugiranje gelska filtracija dializa, ultrafiltracija ionsko-izmenjevalna kromatografija kromatofokusing elektroforeza izoelektrični fokusing hidrofobna kromatografija sprememba p sprememba v ionski jakosti sprememba dielektrične konstante afinitetna kromatografija afinitetna elucija vezava na barvilo vezava na barvilo 2 S 3 Cibacrom Blue F3g-A Cl S 3 S 3 3S S 3 3S Cl S 3 Cl 3S Porcion Red E-3B S 3 metode separacije lastnosti metoda velikost polarnost naboj topnost specifičnost hidrofobnost centrifugiranje gelska filtracija dializa, ultrafiltracija ionsko-izmenjevalna kromatografija kromatofokusing elektroforeza izoelektrični fokusing hidrofobna kromatografija sprememba p sprememba v ionski jakosti sprememba dielektrične konstante afinitetna kromatografija afinitetna elucija vezava na barvilo vezava na kovinski ion imunoadsorbcija kovalentna kromatografija 4

5 kovalentna kromatografija S S + RS S S R + S R S S + SRS + R -S-S-R kriteriji čistosti metoda elektroforeza ads PAGE IEF -terminalna analiza masna spektrometrija razlaga dobra metoda dobra metoda, predvsem v smislu proteoliznih dogajanj in za encime z več podenotami zelo občutljiva metoda težave le v primeru, ko je -terminalna ak blokirana določimo lahko Mr in posttranslacijske modifikacije Kako do večjih količin proteina s pomočjo tehnike rekombinantne tehnologije izolacija majhne količine proteina (µg) elektroforeza -terminalno zaporedje namnožitev zaporedja iskanje po ustrezni DA knjižnici sinteza nukleotidne probe vnos v primernega gostitelja protein 5

6 Prednosti dela z rekombinantnimi proteini visoki izkoristki za terapevtske ali strukturne namene enostavno in hitro čiščenje ko je enkrat konstrukt narejen predstavlja brezmejni izvor proteina originalne celice, tkiva niso več potrebna Prokariontski gostitelji in vektorji gostitelji: najpogosteje E. coli vektorji: najpogosteje plazmidi ( pet serija plazmidnih vektorjev) vnos gena: transformacija: toplotni šok elektroporacija pet ekspresijski sistem DA fragment kloniramo v MCS mesto takoj za T7 fagnim promotorjem (močan) T7 promotor RBS ATG MCS insert terminator ATG insert je bodisi genomska DA, če gre za prokarionte, vendar MRA biti v oliki cda, ko delamo z eukarionti 6

7 pet ekspresijski sistem potrebuje E.coli sev, ki je AREJE tako, da izraža tudi fagno T7 RA polimerazo lac promotor gen T7 RA-polimeraza IPTG T7 RA polimeraza T7 RA polimerazaje je pod kontrolo lac promotorja in se eksprimira le v prisotnosti laktoze ali laktoznega analoga: izopropil trigalactozid (IPTG) gostiteljeva celica je sedaj sposobna prepisovati gene, ki so vstavljeni za T7 promotorjem, se pravi gene z zapisom željenega proteina pet ekspresijski sistem kloniramo DA fragment v MCS takoj za T7 fagnim promotorjem izvedemo transformacijo v E.coli sev, ki izraža T7 RApolimerazo (pod kontrolo lac promotorja) selekcija transformant na osnovi ampicilinske rezistence indukcija ekspresije T7 RA-polimeraze z IPTG ATG insert T7 promotor mra ATG 5' 3' ekspresija proteina iz pet vektorja ST I ST I standardi molekulskih mas brez indukcije indukcija z IPTG rekombinatni protein še potrebuje čiščenje 7

8 Težave, ki se pojavijo pri produkciji proteinov v prokariontih Proteini lahko tvorijo netopne agregate znotraj celice inkluzijska telesa Proteini so lahko nestabilni in se hitro razgradijo Proteini evkariontskega izvora so lahko biološko neaktivni ker nimajo post-translacijskih modifikacij fosforilacija, glikozilacija, pravilna namestitev disulfidnih vezi Če je protein namenjen v terapevtske namene potem mora biti zelo čist, predvsem glede pirogenov Evkariontski gostitelji in vektorji Gostitelji: kvasovke: Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris živalske ali rastlinske celice (insektne celice) živali ali rastline (transgene) Vektorji: plazmidi- ponavadi jim pravimo "shuttle" vektorji virusi Evkariontski expresijski vektor bla ori E ori euk t esm p t mcs p orie E. coli izhodišče replikacije orieuk evkariontskoizhodišče replikacije bla E. coli selekcijski marker esm evkariontski selekcijski marker mcs multiplo mesto za kloniranje p evkariontski promotor t evkariontskiterminator vnos gena transfekcija kalcijev fosfat elektroporacija reagenti, ki delujejo na lipide infekcija DA vnos se izvede preko virusnega delca 8

9 lastnosti posameznih sistemov E. coli enostaven sistem za delo, hitra rast priprava proteinov v velikih količinah ni post-translacijskih modifikacij (glikozilacija) prekomerna ekspresija vodi do nalaganja v inkluzijska telesa Baculo virus težave pri vzdrževanju sistema proteininska ko-ekspresija eukariontske post-translacijske modifikacije, sekrecija proteina Pichia pastoris cenejši in enostavnejši sistem kot Baculo virus višji izkoristki kot pri Baculo virus pravilno zvijanje, glikozilacija težave pri čiščenju priveski proteinov za lažje čiščenje histidinski privesek (is Tag) glutation S-transferaza (GST) maltoza vezalni protein (MBP) kalmodulin vezavni peptid (CBP) istidinski privesek ATG vnos gena ATGCATCATCATCATCATCATXXXXXXAAABBBCCC--- MetisisisisisisXxxXxxAaaBbbCcc--- 9

10 istidinski privesek agaroza M i 2+ XXX M X X X X i 2+ XXX delovanje nikelj-afinitetne kromatografije i 2+ koordinacijski kompleks X X X X istidinski privesek kovinsko-kelatna kromatografija deluje pod nativnimi in denaturacijskimi pogoji privesek je relativno majhen in neškodljiv namestitev priveska -ali C-konec velika dostopnost izvedba kromatografije mm imidazol v pufru 300 mm imidazol v pufru GST (glutation S-transferaza) glutation S-transferaza (26 kda) veže se z veliko afiniteto na glutation, vezan na nosilec elucija prosti glutation cepitev GST s proteazo cepitev s Faktorjem Xa cepitev s trombinom splošne značilnosti fuzija v dimer dimer je zelo stabilen C 2 C C 2 S C C 2C C 3 Glutation je vezan na nosilec. jegova struktura je komplementarna z vezavnim mestom encima glutation S-transferaze. 10

11 MBP ( protein, ki se veže na maltozo) protein, ki se veže na maltozo 45 kda protein povezan je preko linkerja, kar omogoča fleksibilnost in dostopnost peptida čiščenje na nosilcu iz amiloze, elucija z maltozo amiloza zapis za želeni protein mal E MCS laczα kloniranje in ekspresija cepitveno mesto za proteaze MBP želeni protein nanos in spiranje MBP želeni protein splošne značilnosti dobra alternativa GST velik privesek za fuzijo z majhnimi peptidi MBP MBP elucija z maltozo želeni protein cepitev s proteazo želeni protein CBP (kalmodulin vezujoči peptid) CBP vezan na želeni protein (4kDa) kalmodulin (16 kda) vezan na nosilec vezava pri nizki koncentraciji Ca 2+ elucija 2 mm EGTA, neutralni p splošne značilnosti manjši vpliv na protein, ni nujna odstranitev možna je vključitev cepitvenega mesta za proteinazo nežni pogoji dela MIŠICA adenilat-kinaza mišica ekstrakcija v 0.01 M KCl ekstrakt inkubacija pri p 3.5, nato pri p 7.5 supernatant fosfoceluloza; elucija z 5 mm AMP zbrane aktivne frakcije Mg 2+ ATP + AMP 2ADP zbrane aktivne frakcije koncentriranje z ( 4 ) 2 S 4 kristaliničen encim kristalizacija z 62% nasičenjem ( 4 ) 2 S 4 vse stopnje so izvedene pri T od 0-5 o C 11

12 tabela izkoristka stopnja celotni volumen (ml) celokupni protein (mg) aktivnost (katal) specifična aktivnost (katal/kg) izkoristek (%) faktor očiščenja na stopnjo ekstrakcija (100) (1.0) p fosfoceluloza gelska filtracija kristalizacija Iz 6 kg mišic dobimo 435 g topnega proteina od tega je 344 mg encima adenilat-kinaze ŠPIAČA špinačni listi ribuloza bifosfat-karboksilaza 2+ D-ribuloza-1,5-bifosfat + C Mg fosfo-D-glicerat 2+ D-ribuloza-1,5-bifosfat + Mg 2 3-fosfo-D-glicerat + 2-fosfoglikolat zmleti listi v pufru; filtriranje; centrifugiranje (polivinil pirolidon) supernatant PEG 4000 do 18%; centrifugiranje supernatant 20 mm MgCl 2 oborina nanos na DEAE celulozo; gradientna elucija z M ac 3 zbrane aktivne frakcije čisti encim dodatek ( 4 ) 2 S 4 vse stopnje so izvedene pri T 4 o C E.coli zmrznjene celice RA-polimeraza rigorozno razbijanje celic (steklene kroglice), deoksiriboza-nukleaza ekstrakt sonifikacija centrifugiranje supernatant frakcionacija z ( 4 ) 2 S 4 oborina raztapljanje, nanos na DEAE celulozo; elucija z KCl zbrane aktivne frakcije kromatografija na fosfocelulozi, elucija z KCl zbrane aktivne frakcije gelska filtracija Biogel A čisti encim vse stopnje so izvedene pri T 0-5 o C 12

13 Celična kultura celična kultura suspenzija membran adenilat ciklaza ATP 3' : 5' camp + pirofosfat infekcija z rekombinantnim bakulo virusom, liza celic, centrifugiranje dodecilmaltozid, homogeniziranje, centrifugiranje 2C supernatant nanos na forskolin-sefarozo, elucija s forskolinom zbrane aktivne frakcije nanos na i 2+ afinitetno kolono, elucija z imidazolom čisti encim vse stopnje so izvedene pri T 4 o C C C 3 C 3 C C 3 C 3C 3 Rekombinantni protein kimozin celična suspenzija E. coli liza celic (sonifikacija), centrifugiranje (12000g, 5 min) inkluzijska telesa spiranje, solubilizacija v 8M urei, razredčenje v pufru p 10.7 popravek p na 8.0 raztopljen prokimozin nanos na DEAE-celulozo, elucija z gradientom acl M acl čisti prokimozin inkubacija pri p 6.0 aktivni kimozin uporabna metoda (%) metoda rekombinantni proteini nerekombinantni proteini (40) (94) ionska izmenjava elektroforeza 0 4 kromatofokusing 0 3 izoelektrični fokusing 1 0 gelska filtracija reverzna kromatografija 3 19 hidrofobna interakcijska kr afinitetna kromatografija kovinsko kelatna kromatografija 4 6 vezava na barvilo 6 14 kovalentna kromatografija 0 1 kromatografija na hidroksiapatitu 7 16 vsota število krom. stopenj