VPLIV ENDOTELIJA NA TONUS ARTERIJ TEORIJA IN MODELI

Transcription

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO Oddelek za fiziko Oddelek za biologijo Diplomsko delo VPLIV ENDOTELIJA NA TONUS ARTERIJ TEORIJA IN MODELI Oddelek za fiziko FNM Mentor: doc. dr. Aleš Fajmut Somentor: doc. dr. Marko Gosak Kandidatka: Nina Opaka Oddelek za biologijo FNM Mentorica: doc. dr. Saša Lipovšek Maribor, 2013

2 ZAHVALA Zahvaljujem se mentorici doc. dr. Saši Lipovšek, mentorju doc. dr. Alešu Fajmutu in somentorju doc. dr. Marku Gosaku za pomoč in nasvete pri izdelavi diplomskega dela. Zahvaljujem se tudi svoji družini, ki mi je omogočila študij, me pri njem spodbujala in razumela, ter Kristjanu za vse spodbudne besede in razumevanje.

3 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO I Z J A V A Podpisana Nina Opaka, rojena , študentka Fakultete za naravoslovje in matematiko Univerze v Mariboru, študijskega programa Fizika in biologija, izjavljam, da je skupno diplomsko delo z naslovom VPLIV ENDOTELIJA NA TONUS ARTERIJ TEORIJA IN MODELI pri mentorici doc. dr. Saši Lipovšek, mentorju doc. dr. Alešu Fajmutu in somentorju doc. dr. Marku Gosaku, avtorsko delo. V diplomskem delu so uporabljeni viri in literatura korektno navedeni; teksti in druge oblike zapisov niso uporabljeni brez navedbe avtorjev. Maribor, Podpis: III

4 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO Opaka N.: Vpliv endotelija na tonus arterij teorija in modeli. Diplomsko delo, Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za fiziko, Oddelek za biologijo, IZVLEČEK: V diplomskem delu so podrobneje opisani procesi, ki vodijo do relaksacije gladke mišične celice in izvirajo iz endotelija. Osrednja tema naloge je opis in študij ključnega vazorelaksanta, ki se proizvaja v endoteliju, to je dušikov oksid (NO). V delu je opisan proces njegove sinteze in njegov vpliv na od kalcija odvisno relaksacijo gladke mišične celice. Najprej je opisan proces krčenja/relaksacije gladke mišične celice in celična signalizacijo ter pomen kalcija v celici. Podrobneje so opisane različne funkcije, na katere vpliva NO. Z matematičnim modelom je opisana sinteza NO iz L-arginina, ki ga katalizira encim endotelijska NO sintaza (enos). Pri tem je predstavljeno spreminjanje hitrosti nastajanja NO, nitrita in L-citrulina ter porabe kisika in nikotinamid adenin dinukleotid fosfat-oksidaze (NADPH). Prikazana je tudi odvisnost koncentracije NO od koncentracije O 2 v celici. Teoretično je opisano delovanje encima endotelijske NO sintaze in različni vplivi na aktivacijo le-tega. Opisane so različne molekule, ki predstavljajo tarče za NO. Mehanizem aktivacije gvanilat ciklaze je opisan z matematičnim modelom. Predstavljeni so še drugi mehanizmi signalizacije v gladki mišični celici. Z matematično-fizikalnim modelom je opisana dinamika kalcija v gladki mišični in endotelijski celici, pri čemer se osredotočimo na znotrajcelično dinamiko koncentracije kalcija v citosolu tako izolirane gladke mišične celice kakor tudi sklopljenega para gladke mišične celice in endotelijske celice. Ključne besede: dušikov oksid, gladka mišična celica, endotelijska celica, endotelijska NO sintaza, gvanilat ciklaza IV

5 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO Opaka N.: Impact of endothelium on arterial tone theory and models. Graduation Thesis, University of Maribor, Faculty of Natural Sciences and Mathematics, Department of Physics, Department of Biology, Abstract: In the thesis we describe processes that lead to smooth muscle cell relaxation and originate from endothelium. The main topic of the thesis is study and description of key vasorelaxant that is produced in endothelium, which is nitric oxide. We discuss the process of its synthesis and its effect on calcium dependent relaxation of smooth muscle cells. First, it describes the process of contraction / relaxation of smooth muscle cells and cell signaling, and the importance of calcium in the cell. Different functions that are affected by NO are described more specifically. We use a mathematical model to describe the synthesis of NO from L-arginine, which is catalyzed by the enzyme endothelial NO synthase (enos). Enzyme endothelial NO synthase and effects of various substances on its activation are described theoretically. We also present variety of molecules that represent targets for NO. The mechanism of activation of guanylate cyclase is described with a mathematical model. We also describe other signaling mechanisms in smooth muscle cells. We use the third mathematical model to describe the dynamics of calcium in the smooth muscle and endothelial cells, focusing on the dynamics of intracellular calcium concentration in the cytosol of isolated smooth muscle cell as well as coupled pair of smooth muscle cell and endothelial cell. Key words: nitric oxide, smooth muscle cell, endothelial cell, endothelial NO synthase, guanylate cyclase V

6 Pogosto uporabljene okrajšave CaM kalmodulin camp ciklični adenozin monofosfat cgmp ciklični gvanozin monofosfat CICR izpust kalcija, ki ga inducira kalcij (ang. calcium-induced calcium release) DAG diacilglicerol EC endotelijska celica EDTA etilendiamintetraocetna kislina enos endotelijska NO sintaza (ang. endothelial nitric oxide synthase) EPHF endotelijsko pridobljen hiperpolarizacijski faktor EPRF endotelijsko pridobljen relaksacijski faktor ER endoplazemski retikulum FAD flavin adenin dinukleotid FMN flavin mononukleotid GMC gladka mišična celica GTP gvanozin trifosfat inos inducirana NO sintaza (ang. inducible nitric oxide synthase) IP 3 inozitol trifosfat MBS podenota, ki veže miozin (ang. myosin-binding subunit) MLC lahke verige miozina (ang. myosin light chains) MLCK kinaza lahkih verig miozina MLCP fosfataza lahkih verig miozina nnos nevronalna NO sintaza (ang. neuronal nitric oxide synthase) NO dušikov oksid NOHA N ω -hidroksi-l-arginina NOS sintaza dušikovega oksida (ang. nitric oxide synthase) NRKK napetostno regulirani kalcijevi kanali PI fosfatidilinozitol PIP fosfatidilinozitol fosfat PIP 2 fosfatidilinozitol bifosfat PKA protein kinaza A PKC protein kinaza C VI

7 PKG protein kinaza G PLC fosfolipaza C RNS reaktivne dušikove spojine ROS reaktivne kisikove spojine SERCA Ca 2+ -ATPaza sarkoplazemskega/endoplazemskega retikuluma sgc topna gvanilat ciklaza (sgc; ang. soluble gunilyl cyclase) SR sarkoplazemski retikulum STOC spontani prehodni pasivni tok (ang. spontaneous transient outward current) VASP fosfoprotein, ki ga stimulirajo vazodilatorji (ang. vasodilator-stimulated phosphoprotein) VEGF žilni endotelijski rastni faktor (ang. vascular endothelial growth factor) VII

8 Kazalo 1 UVOD CELIČNA SIGNALIZACIJA Mehanizmi celične komunikacije Kalcij v celici Kalcijeva signalizacija ENDOTELIJ BIOLOGIJA DUŠIKOVEGA OKSIDA Lastnosti in funkcije NO Sinteza v bioloških sistemih Endotelijska NOS Uravnavanje bioaktivnosti NO Aktivacija gvanilat ciklaze SIGNALNI MEHANIZMI V GLADKI MIŠIČNI CELICI ARTERIJE Signalizacija v procesu vazokonstrikcije Signalizacija v procesu vazodilatacije MATEMATIČNI MODELI Model katalize enos in produkcije NO Model aktivacije gvanilat ciklaze Dinamika kalcija v gladki mišični celici in v endoteliju Medcelična komunikacija REZULTATI IN RAZPRAVA ZAKLJUČEK VIRI

9 1 UVOD Dušik, prevladujoči plin v zraku, tvori ob oksidaciji dušikov oksid (NO). Dušikov oksid je majhna molekula, pri kateri pa je bilo opaženih nekaj nenavadnih in zelo zanimivih lastnosti. Zaradi neželenih vplivov na okolje preko sodelovanja pri tanjšanju ozonske plasti in tvorbi kislega dežja, je bil dušikov oksid obravnavan kot neželena substanca. NO velja za najpogostejši onesnaževalec zraka zaradi visoke vsebnosti le-tega v izpušnih plinih [1]. NO je tudi zelo nestabilna in reaktivna substanca. Z drugimi substancami reagira hitro in burno, npr. pretvorba iz NO do nitrata ali nitrita se lahko zgodi v nekaj sekundah [1]. Kljub vedenju o prisotnosti in sintezi NO v bakterijah, njegovi vlogi v drugih organizmih znansteniki niso pripisovali posebnega pomena [1]. Toda v zadnjih desetletjih so bile odkrite fiziološke vloge NO, ki so povečale pomen te molekule [5]. S prehranskimi študijami so leta 1916 odkrili, da se v telesu proizvaja dušikov oksid (NO). Opazili so namreč, da je količina izločenih nitratov večja od zaužitih [6]. Takrat so domnevali, da odvečni nitrati izvirajo iz mikroorganizmov v črevesju in da niso povezani s fiziološkimi procesi v celicah sesalcev. Ta opažanja več desetletij niso pritegnila posebnega zanimanja, dokler niso Green in sodelavci (1981) pokazali, da se molekule, ki vsebujejo dušik, sintetizirajo večinoma izven črevesja [7]. Najpomembnejši raziskovalci, ki so odkrivali pomen dušikovega oksida v biologiji so bili Robert Fruchgott, Louis Ignarro, Ferid Murad in Salvador Moncada. Frucggott, Ignarro in Murad so za odkritje NO kot signalne molekule leta 1998 prejeli Nobelovo nagrado za fiziologijo/medicino [2]. Leta 1977 je Murad analiziral efekte vazodilatornih substanc na kardiovaskularni sistem. Na osnovi rezultatov meritev je sklepal, da nitroglicerin povzroča tvorbo NO v telesu in sproža relaksacijo gladke mišične celice. Kljub tem ugotovitvam pa ni nadaljeval s poskusi, s katerimi bi pojasnil vlogo NO pri uravnavanju tonusa gladke mišične celice [1]. Na področju kardiovaskularne biologije sta Fruchgott in Zwadzki leta 1980 prišla do pomembne ugotovitve. Pokazala sta, da po odstranitvi endotelija iz žilnih sten aceteilholin inducira krčenje gladkih mišičnih celic, medtem ko je njegov učinek v primeru nedotaknjenega endotelija v steni žil ravno obraten [5]. Vazodilatorni efekt bi naj inducirala substanca, ki nastaja v endoteliju in se iz njega sprošča ob stimulaciji z acetilholinom.. To substanco so najprej poimenovali 2

10 endotelijsko pridobljen relaksacijski faktor (EPRF; angl. endothelium-derived relaxing factor). Pozneje so odkrili, da lahko tudi drugi agonisti, kot so npr. histamin, serotonin, bradikinin, povzročajo sproščanje EPRF. Ignarro je sklepal, da bi lahko NO bil vzrok za relaksacijo vaskularnih gladkih mišičnih celic in da bi lahko bil ciklični gvanozin monofosfat (cgmp) njegov sekundarni prenašalec. Zato je leta 1979 izvedel eksperiment, pri katerem je pokazal, da je metilen inhibiral vazorelaksacijski efekt NO [1]. Metilen je znan inhibitor gvanilat ciklaze, ki pa katalizira proizvodnjo cgmp v celici. Leta 1983 je Ignarro odkril, da je EPRF po biokemijskih in farmakoloških lastnostih podoben NO. Malo po tem je Moncada s sodelavci [8] pokazal, da je biološka funkcija EPRF povezana z izločanjem NO. V procesu od endotelija odvisne relaksacije gladkih mišičnih celic so odkrili od L-arginina odvisno izločanje NO. Na osnovi rezultatov omenjenih raziskav so sklepali, da je EPRF v bistvu NO. Od takrat dalje so se številni raziskovalci osredotočali na preučevanje učinkov NO v različnih vrstah celic in tkiv [9,10]. Odkrili so, da acetilholin, ki ga sproščajo avtonomni živci ob stenah žile, regulira tonus gladkih mišičnih celic (slika 1). Acetilholin inducira proizvodnjo in izpust NO iz endotelija, ki povzroči relaksacijo gladke mišične celice. NO se v gladki mišični celici veže na železo na aktivni strani encima gvanilat ciklaze in tako sproži pretvarjanje gvanozin trifosfata (GTP) v ciklični gvanozin monofosfat (cgmp), ki pozitivno vpliva na mehanizme, ki vodijo do hitre relaksacije gladke mišične celice [11]. Odkritje vplivov NO na kardiovaskularni sistem je presenetilo znanstvenike. NO se od tipičnih signalnih molekul razlikuje že po tem, da je plin. Poleg tega se ne proizvaja vnaprej in se ne sprošča z eksocitozo temveč z difuzijo [3]. Prava senzacija je bilo tudi dejstvo, da lahko ima običajen»onesnanževalec zraka«, ki nastaja pri oksidaciji dušika in se sprošča z izpušnimi plini, tako pomembno vlogo v uravnavanju funkcij v človeškem telesu. Leta 1992 je revija Science imenovala NO za molekulo leta, vendar je trajalo še 6 let, da so trije najpomembnejši znanstveniki za odkritje vloge NO v telesu prejeli Nobelovo nagrado [4]. Čeprav je okritje vloge dušikovega oksida v kardiovaskularnem in živčnem sistemu staro že več desetletij, še vedno ostajajo nerazkrita področja, na primer v klinični uporabi. 3

11 Slika 1: Od NO odvisna regulacija tonusa gladke mišične celice [11] Namen diplomskega dela je podrobneje opisati procese od sinteze dušikovega oksida do sproščanja gladke mišične celice. Nekatere od teh procesov bom opisala z matematičnimi modeli. S prvim matematičnim modelom bom opisala kinetiko katalize encima endotelijske NO sintaze. Rezultati bodo zajemali spreminjanje hitrosti nastanka NO in L-citrulina ter porabe O 2 in NADPH. V drugem modelu bom predstavila aktivacijo ciklične gvanilat ciklaze, pri čemer bom preverila, kako je aktivacija ciklične gvanilat ciklaze odvisna od koncentracije NO v celici. S tretjim matematičnim modelom bom predstavila dinamiko kalcija v gladki mišični celici in enoteliju. Rezultati zajemajo prikaz in analizo dinamike koncentracije kalcija v citosolu tako izolirane gladke mišične celice kakor tudi sklopljenega para gladke mišične celice in endotelijske celice. 2 CELIČNA SIGNALIZACIJA 2.1 Mehanizmi celične komunikacije Komunikacija med celicami ne temelji samo na prenosu kemičnih signalov med dvema celicama, temveč vključuje kompleksne intracelularne mehanizme. Ti mehanizmi so potrebni za nadzor informacij, ki jih oddaja celica ob določenem času, in za interpretacijo informacij. Komunikacijo med celicami omogočajo ekstracelularne signalne molekule, ki jih sintetizirajo in izločajo t.i. signalne celice. Sprejem informacij 4

12 temelji na receptorskih proteinih, ki se večinoma (ne pa zmeraj) nahajajo na površini celice in na katere se vežejo signalne molekule. Vezava signalne molekule aktivira receptor, kar sproži intracelularno signalno pot, kar pomeni, da se preko intracelularnih signalnih proteinov aktivirajo efektorski proteini. Aktivacija efektorskih proteinov povzroči spremembo v delovanju celice. Odvisno od vrste celice so efektorski proteini lahko ionski kanali, komponente metabolne poti, deli citoskeleta ali genski regulatorni proteini (slika 2) [11]. Slika 2: Enostavna intercelularna signalna pot, ki jo aktivira ekstracelularna signalna molekula (prirejeno po [11]). Celice v mnogoceličnih organizmih komunicirajo s pomočjo različnih signalnih molekul, med katere štejemo proteine, manjše peptide, aminokisline, nukleotide, steroide, retinoide, derivate maščobnih kislin in tudi raztopljene pline, npr. dušikov oksid (NO). Večina molekul se izloča iz signalne celice z eksocitozo, nekatere lahko prehajajo tudi direktno skozi membrano ali so pritrjene na zunanji površini celice in se ne odcepijo. Ekstracelularne signalne molekule delujejo pri dokaj nizkih koncentracijah 5

13 (tipično okrog 10-8 M ali manj), receptorji pa imajo visoko afiniteto za te molekule. Receptorji za številne signalne molekule so transmembranski proteini v plazmalemi tarčne celice. Nekatere signalne molekule, ki so dovolj majhne in hidrofobne, pa prehajajo skozi lipidni dvosloj v notranjost tarčne celice brez vezave na receptor. Te signalne molekule imajo receptorje v jedru celice. Signalne molekule, ki ostanejo vezane na membrano signalne celice, lahko vplivajo samo na celice, s katerimi pridejo v stik. Temu pravimo kontaktna signalizacija (slika 3a), ki je še posebej pomembna pri zgodnjem embrionalnem razvoju organizma in imunskem odzivu. Pri razvoju lahko kontaktne signalne molekule delujejo na relativno dolge razdalje, saj celice prenesejo signale dalje s celice na celico. Vendar pa signalne celice v večini primerov izločajo signalne molekule v medcelično tekočino. Izločene signalne molekule lahko potujejo na daljše razdalje in delujejo na oddaljene tarčne celice ali delujejo samo na bližnje celice (lokalni mediatorji). V primeru, da molekule delujejo lokalno, se proces imenuje parakrina signalizacija (slika 3b). Ponavadi sta signalna in tarčna celica različni celici, vendar pa lahko celice proizvajajo tudi signalne molekule, na katere se odzivajo same. Procesu pravimo avtokrina signalizacija. Večji, kompleksnejši večcelični organizmi potrebujejo še signalni mehanizem, ki je učinkovit na večje razdalje in koordinira delovanje celic v oddaljenih delih organizma. Tako so se razvili tipi celic, ki so specializirani za intercelularno komunikacijo na velike razdalje. Primer so živčne celice, nevroni, ki z dolgimi izrastki, aksoni, omogočajo stik z oddaljenimi celicami (slika 3c). Po nevronih se prenaša električni signal akcijski potencial, ki povzroči sproščanje nevrotransmiterja v sinaptično špranjo. Nevrotransmiter se nato veže na specifične receptorje na postsinaptični celici (slika 3c). Drugi način signalizacije na dolge razdalje predstavljajo endokrine celice, ki izločajo signalne molekule, hormone, v krvni obtok (slika 3d). Po krvnem obtoku se signalne molekule prenesejo do oddaljenih tarčnih celic kjerkoli v organizmu [11]. 6

14 Slika 3: Oblike intercelularne signalizacije: a) kontaktna, b) parakrina, c) sinaptična in d) endokrina signalizacija [11]. 2.2 Kalcij v celici Kalcij je kemijski element druge skupine periodnega sistema in spada med zemeljskoalkalijske kovine. Je peti najpogostejši element v zemeljski skorji, izredno pomemben pa je tudi v živi naravi, kjer omogoča številne fiziološke procese. Kalcij ima v bioloških sistemih pomembno vlogo. V človeškem telesu je večina kalcija shranjena v obliki kalcijevega fosfata v kosteh in zobeh (99,9%), le majhen delež pa je v obliki kalcijevega iona Ca 2+ v medcelični raztopini in v notranjosti celice. V nekaterih celičnih organelih, ki jih imenujemo kalcijeve shrambe (npr. endoplazemski retikulum), je koncentracija kalcija višja. Kljub relativno majhni koncentraciji kalcija znotraj celice, imajo kalcijevi ioni pomembno vlogo v številnih temeljnih celičnih procesih, npr. pri delitvi celice, regulaciji metabolizma, kontrakciji mišičnih celic, izločanju, oploditvi, prenosu informacij med sinapsami, metabolizmu, prepisovanju dednega materiala, premikanju celic ter pri celični smrti [12]. Zaradi pomena, ki ga ima kalcij v življenju celice, je 7

15 koncentracija njegovih ionov natančno nadzorovana. V citosolu celice je koncentracija kalcijevih ionov lahko zelo nizka, navadno približno 10-7 mol/l, v zunajceličnem prostoru in endoplazemskem retikulumu je koncentracija kalcijevih ionov običajno krat višja [12]. V večini primerov kalcijevi ioni delujejo kot sekundarni prenašalci informacij, saj se vežejo z veliko različnimi molekulami in povzročijo različne odzive celice. Vrsta odziva celice na spremembe v koncentraciji citosolnega kalcija je odvisna od tipa celice in od oblike kalcijevega signala [11]. SINAPSE IN EKSOCITOZA: Ko živčni impulz v obliki akcijskega potenciala doseže terminalni del aksona presinaptične celice, depolarizacija povzroči odprtje Ca 2+ kanalov v tem delu plazmaleme celice. Ker je v zunajceličnem prostoru koncentracija kalcijevih ionov višja kot v citosolu celice, odprtje kanalov povzroči difuzijo ionov v celico, zaradi česar se koncentracija le-teh znotraj celice poviša. Kalcijevi ioni se vežejo na specifične molekule, ki sprožijo zlitje sinaptičnih veziklov s plazmalemo [12]. OPLODITEV, DELITEV CELICE: Tudi pri oploditvi celice ima kalcij ključno vlogo. Njegova koncentracija se širi od mesta, kjer je vstopil spermij, po celotni jajčni celici. Povišana koncentracija kalcija v takšni celici sproži številne reakcije, med drugim tudi aktivacijo od ciklina odvisne kinaze, ki omogoči prvo mitotsko delitev zigote [12]. Zaradi povišanja koncentracije kalcijevih ionov v jajčni celici postane njena plazmalema neprepustna za druge spermije, s čimer se prepreči, da bi jajčece oplodilo več spermijev, kar bi vodilo do nepravilnega razvoja zarodka [13]. KRČENJE SKELETNIH MIŠIC: Mišične celice so sposobne krčenja zaradi prisotnosti aktinskih in miozinskih filamentov, ki tvorijo osnovne strukturne in funkcionalne enote mišične celice sarkomere. Krčenje celice je posledica skrajšanja sarkomere zaradi drsenja miozinskih filamentov ob aktinskih, za kar pa so ključnega pomena molekule ATP in kalcijevi ioni. Da se celica lahko skrči, se morajo najprej miozinske glave vezati z aktinom, kar pa je mogoče, kadar je prisotna dovolj visoka koncetracija kalcijevih ionov. Na aktinske filamente sta namreč vezana še dva pomožna proteina: tropomiozin in troponin. Tropomiozin je vezan vzdolž aktinskih filamentov in prekriva mesta za vezavo miozina. Troponin pa je sestavljen iz treh delov: troponina C, ki veže Ca 2+, inhibitornega troponina I in troponina T, ki omogoča vezavo kompleksa troponinov na tropomiozin (slika 4a). Ko se ob povišani koncentraciji kalcijevih ionov kalcij veže na troponin C, troponinski kompleks spremeni obliko in odmakne tropomiozin z vezavnih 8

16 mest za miozinske glave (slika 4b) [11,13]. Ob prisotnosti ATP se mišična celica zdaj lahko skrči. Miozinske glave se povežejo z aktinom v aktinskem filamentu. Vezava in nato hidroliza ATP povzroči konformacijske spremembe v glavi miozina in ta se premakne na nov položaj ter se po odcepitvi P in ADP ponovno konformacijsko spremeni in s tem premakne aktinski filament, zaradi česar se mišična celica skrči [13]. Slika 4: a) Tanki filament skeletne mišice. b) Kalcijev ion se veže na troponin C, kar povzroči odmik tropomiozina in vezavo miozina na aktin [11]. KALCIJ IN CELIČNA SMRT: Čeprav celice brez kalcijevih ionov ne bi preživele, pa lahko prekomerno povišana koncentracija sproži proces apoptoze. Bax je eden izmed proapoptotskih proteinov, ki je prisoten v citosolu celice, vendar je v neaktivni obliki. Čezmerno povišanje koncentracije kalcijevih ionov aktivira ta protein, ki se premakne v mitohondrijsko membrano in poveča prepustnost le-te za mitohondrijski citokrom c, ki se začne sproščati v citosol. Citokrom c povzroči aktivacijo kaspaz 9, ki pospešijo apoptozo s tem, da aktivirajo še ostale kaspaze, posebne proteaze, ki so udeležene pri razgradnji celičnih sestavin [13] Kalcijeva signalizacija Prvič so eksperimentalno potrdili sodelovanje kalcija pri prenosu celičnih signalov leta 1947 [14]. Po vbrizganju kalcija v mišico žabe so opazili kontrakcijo mišičnih celic, pri vbrizganju magnezija, natrija in kalija pa je niso opazili. S kasnejšimi eksperimenti so 9

17 potrdili, da je kalcij pomemben dejavnik v procesu prenosa signala. Največ eksperimentalnih raziskav v zvezi z oscilacijami kalcija je bilo opravljenih na srčnih, jajčnih, jetrnih in gladkih mišičnih celicah, na celicah trebušne slinavke in nevronih. Oblika kalcijevih signalov je močno odvisna od tipa celice pa tudi dražljaji so za vsako celico drugačni. Preučevanje kalcijevih oscilacij se je na teoretičnem nivoju začelo ob koncu osemdesetih let prejšnjega stoletja [14]. Matematični modeli, ki postajajo vedno bolj izpopolnjeni in napredni, temeljijo na opisu tokov, ki opisujejo izmenjavo Ca 2+ med citoplazmo, zunajcelično raztopino in notranjimi kalcijevimi shrambami. Dinamiko modela opišemo s sistemom sklopljenih diferencialnih enačb, ki običajno obravnavajo časovno spreminjanje koncentracij različnih signalnih molekul. Najenostavneši so t.i. minimalni modeli, ki vključujejo samo dve spremenljivki. Običajno je ena izmed spremenljivk koncentracija kalcija v citosolu, druge pa so lahko še na primer kocentracija inozitol trifosfata (IP 3 ), koncentracija Ca 2+ v ER ali mitohondrijih, vrednost membranskega potenciala, itd. Enega izmed prvih preprostih modelov Ca 2+ homeostaze, ki je predvideval oscilirajoče spreminjane koncentracije Ca 2+, sta leta 1991 izdelala Stucki in Smogy [15]. Modelom, ki vsebujejo tri ali več spremenljivk, pravimo večshrambni modeli. Nekateri so lahko tudi zelo podrobni in vsebujejo več kot 30 spremenljivk [16]. Ker je predmet raziskovanja kalcijeve signalizacije zelo obsežen, še zdaleč niso zajeti vsi dejavniki. Glavna prednost matematičnih modelov pred eksperimentalnimi raziskavami je, da lahko sistem hitro testiramo pri različnih vrednostih parametrov in napovemo obnašanje. Hkrati nam lahko ustrezno oblikovan model razkrije podrobnejšo naravo dinamike biokemijskih procesov, kar izključno z eksperimentom ne bi bilo mogoče. V kompleksnih bioloških sistemih, kot je človeško telo, sta usklajenost in dobra komunikacija med posamenznimi celicami, ključna za delovanje organizma. Celica se nenehno odziva na zunanje dražljaje, ki ne delujejo direktno na aktivna mesta v celici, temveč se informacije prenašajo preko posrednikov. V primeru, da je takšen posrednik kalcijev ion, se informacija o dražljaju prenese do aktivnega mesta v celici v obliki oscilacij koncentracij Ca 2+ v citosolu. Z višanjem jakosti dražljaja se navadno povečuje frekvenca oscilacij, amplituda pa se večinoma ne spreminja. Tako pravimo, da je signal frekvenčno kodiran [17]. Oscilacije kalcija so eden izmed najpomembnejših periodičnih 10

18 pojavov na področju biokemije. Njihov nastanek je lahko spontan ali stimuliran s strani hormonov ali nevrotransmiterjev. Predstavljajo učinkovit mehanizem širjenja informacij tako znotraj celic kot med celicami. Signal je izražen z zaporedjem zelo hitrih in kratkotrajnih povišanj koncentracije Ca 2+ v citosolu. Koncentracija se lahko v času povišanja poveča tudi 10-krat. Dolgotrajne prevelike spremembe koncentracije bi bile za celico toksične, zato je bistveno, da koncentracija po nenadnem povišanju tudi hitro pade. Procese, ki spremljajo in regulirajo oscilacije Ca 2+, imenujemo kalcijeva signalizacija. Slika 5: Presledkovni stik [18] Prehajanje intercelularnih signalnih molekul, in tako tudi Ca 2+, omogočajo t.i. presledkovni stiki, ki jih tvorijo specifični proteini koneksini. Šest koneksinov predstavlja konekson v plazmalemi celice. Koneksona dveh sosednjih celic tvorita kanalček, po katerem prehajajo molekule, ki sicer spontano ne morejo prehajati skozi membrano celice (slika 5). Območje kanačkov, preko katerih sta direktno povezani citoplazmi sosednjih celic, imenujemo presledkovni stik (angl. gap junctions). Tovrstni stik uvrščamo glede na njegovo strukturo in funkcijo v družino komunikacijskih stikov. Biokemijske reakcije, ki so ključnega pomena pri nastanku kalcijevih oscilacij (npr. ob holinergični stimulaciji celice), sproži vezava signalne molekule (npr. acetilholina) na receptor v membrani. Zaradi vezave na receptor pride do fosforilacije fosfolipida fosfatidilinozitola (PI), ki se spremeni v fosfatidilinozitol fosfat (PIP) in naprej v fosfatidilinozitol bifosfat (PIP 2 ). Encim fosfolipaza C (PLC) katalizira razpad PIP 2 na 11

19 inositol trifosfat (IP 3 ) in diacilglicerol (DAG). Molekule IP 3 so posredni prenašalec signala po celici in hitro difundirajo do receptorjev na kalcijevih kanalih v membrani endo- ali sarkoplazemskega retikuluma (ER/SR). Vezava na kanale poveča prepustnost za Ca 2+, posledično koncentracija v citoplazmi naraste od 5 do 10-krat. Previsoka koncentracija Ca 2+ inhibira receptorje za IP 3 in jih tako zapre. Poleg vezave IP 3 na kanale v membrani endo- ali sarkoplazemskega retikuluma (ER/SR) se lahko koncentracija kalcija poveča preko izpusta kalcija iz ER/SR, ki deluje na principu mehanizma, pri katerem povišan kalcij v citoplazmi inducira izpust kalcija iz ER/SR. To je t.i. CICR mehanizem (CICR; ang. calcium-induced calcium release). Ob povišanju koncentracije kalcija v citosolu se aktivirajo črpalke Ca 2+ -ATPaze (SERCA), ki prečrpajo kalcij nazaj v ER/SR. Povišana koncentracija kalcija v celici pa povzroči različne spremembe. Lahko povzroči konformacijske spremembe PLC, kar poveča proizvodnji IP 3, in vpliva na PKC, ki bi inhibirala nastajanje IP 3. Proteinom, ki so prejemniki signala, se spremeni konformacija, kar vpliva na celične procese, katere regulirajo. V primeru gladkih mišičnih celic (GMC) sprememba konformacije proteinov generira razvoj sile v mišici in posledično njeno skrčitev. V procesu krčenja mišice so ključnega pomena aktinska in miozinska proteinska vlakna [3]. Na aktinskih vlaknih so aktivna mesta, na katera se miozinsko vlakno veže preko prečnih mostičkov. V procesu krčenja gladkih mišičnih celic morajo biti lahke verige miozina, ki so del vratu prečnega mostička, fosforilirane, kar je tudi bistvena razlika med delovanjem gladkih in prečno progastih mišic. Fosforiliranje lahkih verig miozina sproži kinaza lahkih verig miozina (MLCK), proces pa regulira Ca 2+. Le-ta se ob povišani koncentraciji veže na protein kalmodulin (CaM), kalmodulin pa se veže s kinazo lahkih verig miozina (slika 6). Encim je aktiven, ko je v kompleksu s (Ca 2+ ) 4 -CaM, in tako je omogočena fosforilacija vratu prečnega mostička, le-ti se posledično lahko pripnejo na aktinsko vlakno in prične se proces razvoja sile v mišici. V procesu fosforiliranja se na vrat prečnega mostička veže fosfatna skupina (P) iz ATP. V začetnem stanju (slika 6b) je vrat prečnega mostička fosforiliran, na glavi, kjer prav ttako poteka fosforilacija, pa sta vezana fosfatna skupina (P) in ADP. Miozinska glava se šibko veže na aktivno mesto aktinskega vlakna, kot med miozinsko glavo in aktinskim vlaknom je 90 (slika 6c). V naslednjem koraku se ob sprostitvi fosfatne skupine prečni mostiček najprej močno veže na aktinsko vlakno in se hkrati premakne naprej, tako da je kot med aktinskim vlaknom 12

20 in glavo miozina 45 (slika 6d). Nato se sprosti ADP, prečni mostiček pa ostane še naprej trdno vezan na aktinsko vlakno. Sledi vezava ATP na miozinsko glavo, le-ta se s tem sprosti iz aktinskega vlakna. Miozinska glava je še zmeraj pod kotom 45 glede na aktinsko vlakno (slika 6e) [3]. Ob hidrolizi ATP v ADP na prehodu nazaj v začetno stanje, se glava vrne v stanje, v katerem je kot med glavo in aktinskim vlaknom 90. Slika 6: Mehanizem krčenja gladke mišične celice. a) Aktivacija encima kinaze lahkih verig miozina. b) Fosforiliranje prečnega mostička. c) Šibka vezava miozinske glave na aktivno mesto aktinskega vlakna. d) Močna vezava miozinske glave na aktinsko vlakno in premik naprej. e) Ponovna vezava molekule ATP na glavo prečnega mostička. Legenda: CaM kalmodulin, MK miozin kinaza, ATP adenozin trifosfat, ADP adenozin difosfat, P fosfatna skupina. Proces defosforilacije vrata prečnega mostička regulira encim fosfataza lahkih verig miozina (MLCP; angl. Myosin light-chain phosphatase), kar sproži odpetje oz. zaskočitev prečnih mostičkov na aktinu posledično pa se zniža sila, ki jo le-ti generirajo. Encim MLCP je tudi tarča številnih drugih signalnih poti, ki aktivirajo proteine, ki bodisi inhibirajo ali posredno aktivirajo delovanje encima, s čimer regulirajo razvoj sile v mišici [14]. 13

21 3 ENDOTELIJ Endotelijsko tkivo ali endotelij je enoskladni ploščati epitelij, sestavljen iz ene plasti ploščatih epitelnih celic in bazalne lamine (slika 7). Endotelij je prisoten v limfnih in krvnih žilah, kjer sprošča kemične mediatorje, ki so ključni pri regulaciji premera žile (vazomotoriki). Snovi, kot so npr. majhne hidrofobne molekule, prehajajo skozi selektivno propustno plazmalemo celic enoskladnega ploščatega epitelija s pasivnim prenosom, v glavnem z difuzijo [19]. Poleg izločanja vazoaktivnih substanc ima endotelij še druge funkcije. Predstavlja fizično bariero med krvjo in gladko mišično steno žile, izloča substance, ki stimulirajo tvorbo novih žil, sodeluje pri izmenjavi snovi med krvjo in okoliškim tkivom preko kapilar. Endotelij vpliva tudi na tvorbo in razgradnjo strdkov. Ker se s krčenjem žile spreminjajo velikosti por med endotelijskimi celicami, sodeluje tudi pri določanju prepustnosti kapilar. Za pravilno delovanje endotelija je ključno ravnovesje med dušikovim oksidom in endotelinom-1, ki je fiziološki antagonist NO, deluje vazokonstrikcijsko in prispeva k hipertrofiji žilja in srčne mišice [19]. Slika 7: Mikroskopski preparat prereza arterije [20]. Legenda: 1 plast gladkih mišičnih celic, 2 endotelij, 3 ploščate epitelne celice, 4 bazalna lamina. Povišanje koncentracije Ca 2+ v mišični celici inducira povišanje koncentracije Ca 2+ tudi v endotelijski celici zaradi difuzije IP 3 iz mišične celice v endotelijsko celico. Visoka koncentracija kalcija v endotelijski celici (EC) povzroči izhajanje kalija skozi kalijeve kanale, ki jih aktivira kalcij, kar sproži hiperpolarizacijo. Pri preučevanju vloge povišanja kalcija v endotelijskih celicah obstajata še dve molekuli oz. dejavnika, ki delujeta na gladko mišično celico: endotelijsko pridobljeni relaksacijski faktor (EPRF) 14

22 in endotelijsko pridobljeni hiperpolarizacijski faktor (EPHF). Znano je, da je dušikov oksid (NO) ključni predstavnik EPRF. Le-ta hitro prehaja v gladko mišično celico in tam poveča koncentracijo cgmp (ciklični gvanozin monofosfat), ki zniža koncentracijo kalcija v gladki mišični celici preko različnih mehanizmov: ponovnega polnjenjenja intracelularnih shramb, aktivacije na kalcij občutljivih kalijevih kanalov, stimulacije izmenjevalcev Na + /Ca 2+ in inhibicije produkcije IP 3. Vse to so mehanizmi, ki posledično znižujejo raven kontrakcije gladke mišične celice. Za razliko od EPRF je indentiteta EPHF zaenkrat še neznana. Nedavno so ugotovili, da se hiperpolarizacija širi električno preko mioendotelijskih vrzeli. Hiperpolarizacija nato zmanjša pritok kalcija preko napetostno reguliranih kalcijevih kanalov (NRKK), kar povzroči relaksacijo celice. V nekaterih eksperimentalnih raziskavah so ugotovili, da je prisotnost endotelija nujna za nastanek vazomotorike, vendar pa so to opazili tudi v primerih, ko endotelij ni bil prisoten [21, 22]. V nekaterih študijah so ugotovili, da lahko endotelij zatre vazomotoriko z desinhronizacijo kalcijevega signala [22]. Vsekakor je jasno, da mehanizmi vpliva endotelija na krčenje gladkih mišic niso povsem pojasnjeni, kar spodbuja razvoj različnih matematičnih modelov, ki omogočajo globlji vpogled v delovanje celic. Endotelijska disfunkcija Izraz endotelijska disfunkcija se uporablja za opis različnih patoloških stanj vključno s spremenjenimi proti-vnetnimi lastnostmi endotelija, oslabljeno modulacijo rasti žil in disregulacijo vaskularnega remodeliranja [23]. Vendar pa v večini literature ta izraz opisuje oslabitev od endotelija odvisne vazorelaksacije, do katere pride zaradi zmanjšane bioaktivnosti NO. Različne vplive na biaoktivnost NO bom opisala v nadaljevanju. Zmanjšana bioaktivnost NO v stenah žile zmanjša od endotelija odvisno vazorelaksacijo in zmanjša druge pozitivne učinke NO, kot je npr. zaviranje sprijemanja trombocitov in levkocitov in njihov antiproliferativni učinek [24]. 4 DUŠIKOV OKSID 4.1 Lastnosti in funkcije dušikovega oksida (NO) Dušikov oksid (NO) je pomembna biomolekula. Organski nitriti estrov, ki sproščajo NO, so se uporabljali pri zdravljenju angine pektoris veliko časa preden so prepoznali 15

23 vlogo NO v cirkulaciji. NO spada med reaktivne kisikove spojine (ROS; ang. reactive oxygen species). Med ROS prištevamo tudi proste radikale, ki imajo nesparjen elektron na zunanji orbitali. Ti so poleg NO še superoksidni ion ( ), hidroksilni radikal (HO - ) in lipidni radikali. Druge ROS, med katere spadata vodikov peroksid (H 2 O 2 ) in peroksinitrit (ONOO - ), niso prosti radikali, temveč imajo oksidativni učinek, ki doprinaša k oksidativnemu stresu [25]. Nekatere specifične vloge NO v telesu sesalcev, opisane v osemdesetih letih prejšnjega stoletja, so: - zaščita žilnega sistema: NO, ki se sprošča iz endotelijskih celic, izzove relaksacijo GMC; - sodelovanje v živčnem sistemu oz. prenos živčnih signalov: NO je nevrotransmiter, potreben pri intracelularnemu prenosu signalov; prevelika produkcija NO vodi v celično smrt in izgubo nevrona; - sodelovanje v imunskem sistemu: fagociti proizvajajo NO in ga uporabljajo kot orožje proti celičnim patogenom [25]; - inhibicija aktivacije trombocitov; - relaksacija gladkih mišičnih celic v steni žil; - inhibicija zlepljanja levkocitov; - inhibicija endotelijske permeabilnosti. Prepoznane funkcije NO [26]: - relaksacija gladkih mišičnih celic arteriol in s tem pomembna vloga pri kontroliranju pretoka krvi skozi tkiva in vzdrževanje arteriolnega tlaka; - razširjenje arteriol v penisu in klitorisu; mediator erekcije; - vpliva na trombocite in strjevanje krvi na mestih poškodbe; - nevrotransmiter; - sodeluje pri spremembah, povezanih s spominom; - s sproščanjem gladkih mišičnih celic v prebavnem traktu pomaga uravnavati peristaltiko; - s sproščanjem gladkih mišičnih celic pomaga pri ohranjanju odprtosti poti za dotok zraka v pljuča; - makrofagi z NO uničujejo bakterije in rakaste celice; - potencialna vloga pri relaksaciji skeletnih mišic. 16

24 Dušikov oksid kot signalna molekula Dušikov oksid je pomembna in izjemna signalna molekula, ki je prisotna tako v živalih kot v rastlinah. Pri sesalcih je ena izmed funkcij NO relaksacija srčnih mišičnih celic (po mehanizmu, ki je prikazan na sliki 1), tako se nitroglicerin, ki se v telesu pretvori v NO, že preko 100 let uporablja za zdravljenje angine pektoris. Raztopljeni NO prehaja hitro skozi membrane in hitro difundira iz celice, kjer se proizvaja, v sosednje celice. Deluje samo lokalno, saj ima kratko razpolovno dobo v medcelični tekočini (5 10 sekund), potem se z vezavo s kisikom in vodo pretvori v nitrate in nitrite. Dušikov oksid je primer signalne molekule, ki aktivira receptorje v notranjosti tarčne celice. Molekula NO je dovolj majhna in hidrofobna, da lahko prehaja direktno skozi plazmalemo tarčne celice in v celici neposredno regulira aktivnost intracelularnih proteinov. V nekaterih tarčnih celicah se NO reverzibilno veže na gvanilat ciklazo (sgc) in stimulira produkcijo intracelularne signalne molekule ciklični gvanozin monofosfat (cgmp). Vendar pa lahko NO deluje tudi direktno na ciljna mesta brez posrednega vpliva na produkcijo cgmp. 4.2 Sinteza v bioloških sistemih V nekaterih strukturah, npr. v rastlinskih apoplastih in želodcu sesalcev, je prisotna neencimska emisija NO iz različnih dušikovih oksidov (slika 8a). Neencimska emisija je možna samo pod kislimi pogoji. Večinoma poteka proizvodnja NO preko encimskih reakcij. Nitrat reduktaza je v nekaterih celicah sposobna pretvoriti v NO. Pod hipoksičnimi pogoji mitohondrijska elektronska transportna veriga katalizira redukcijo nitrita (slika 8b) [25]. Slika 8: Sinteza NO v bioloških sistemih. a) Ne-encimska emisija NO. b) Pretvorba nitrata v NO preko encimske reakcije, ki jo katalizira nitrit reduktaza. Legenda: - nitrit, HNO 2 dušikova kislina, N 2 O 3 didušikov trioksid, NO 2 dušikov dioksid, NO dušikov oksid, N 2 O didušikov oksid, N 2 dušik, NirS in NirK nitrit reduktazi. 17

25 Sintezo NO (v sesalcih) iz amino kisline L-arginina katalizira družina encimov, ki jih imenujemo NO sintaze (NOS). NO sintaze katalizirajo od NADPH odvisno oksidacijo L-arginina, pri kateri nastaneta NO in aminokislina L-citrulin (slika 9). Pri tem pride do vmesnega nastanka N ω -hidroksi-l-arginina (NOHA). Prepoznane so tri izoforme NOS. NOS tipa I (nevronalna NOS) in NOS tipa III (endotelijska NOS) sta tako imenovani konstitutivni izoformi. Konstitutivni izoformi sta odvisni od kalcija in inducirata produkcijo NO (piko molarne vrednosti) kot odziv na različne fiziološke dražljaje. NOS tipa II ali inducirana NOS pa generira večje koncentracije NO (nano molarne vrednosti) v daljših časovnih obdobjih. Inducirana NOS naj bi bila neodvisna od kalcija, vendar so novejše raziskave pokazale, da je pri aktivaciji inos prisoten kalmodulin, ki pa potrebuje za aktivacijo nizke koncentracije Ca 2+ [27]. Endotelijsko in nevronalno NOS aktivira Ca 2+ -kalmodulin s povezavo reduktazne in oksigenazne domene. Slika 9: Sinteza NO iz L-arginina [28] Endotelijska NOS Izofroma NOS tipa II je bila izolirana iz endotelijskih celic, zato jo imenujemo tudi endotelijska NO sintaza oz. enos. Njeno aktivnost v glavnem stimulira povečana koncentracija Ca 2+. Kot druge izoforme je tudi enos homodimer, sestavljen iz dveh enakih podenot [29]. Vsaka podenota je sestavljena iz dveh domen. Prva domena je N- terminal. To je oksigenazna oz. heme domena (slika 10), ki katalizira obe stopnji sinteze NO. Ta domena veže substrata O 2 in L-arginin in dve redoks skupini, Fe(III)-heme in 5,6,7,8-tetrahidrobiopterin (H 4 B). Struktura te domene je močno podobna pri vseh treh izoformah NOS. 18

26 Slika 10: Heme skupina [11] Druga domena je C-terminal oz. reduktazna domena, ki predstavlja vir elektronov za reakcijo NOS. Preko treh vezavnih molekul veže nase nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) in dve redoks skupini, flavin adenin dinukleotid (FAD) in flavin mononukleotid (FMN) [30]. NADPH, ki je vezan na reduktazno domeno, posreduje elektron preko FAD in kasneje preko FMN do hema na oksigenazni domeni. Zanimivo je, da reduktazna domena posreduje elektron oksidazni domeni druge podenote. Za sintezo NO mora biti na NOS vezan H 4 B, ki ima funkcijo internega redoks agenta. Če ta skupina ni prisotna, NOS samo katalizira pretvorbo O 2 v H 2 O 2. H 4 B deluje kot interni redoks agent in je med reakcijami, pri katerih nastaja Nω-hidroksi-L-arginin (NOHA) in NO, oksidiran do radikalne oblike H 4 B + in potem reduciran nazaj v obliko H 4 B [30]. Od kalcija odvisna aktivacija enos Do nedavnega so regulacijo endotelijske NOS pripisovali izključno spremembam koncentracije kalcija v endotelijski celici. Vendar pa tudi nestimulirana endotelijska celica proizvaja NO, kar kaže na to, da je bazalna koncentracija kalcija ravno dovolj visoka za produkcijo manjših količin NO. Povečanje endotelijske produkcije NO vzbujata npr. acetilholin in bradikinin, ki povzročata spremembe v koncentraciji Ca 2+. Takšna produkcija NO je odvisna od nastanka kompleksa Ca 2+ /CaM [29]. Interakcija enos s kalmodulinom Kalmodulin (CaM) je bil prvi protein, pri katerem so odkrili interakcijo z NOS. Kalmodulin je pomemben pri encimski aktivnosti vseh treh izoform NOS. Vezava kompleksa Ca 2+ /CaM je nujna za aktivacijo sestavnin encimov. To potrjuje odkritje domene za vezavo kalmodulina v primarni strukturi enos in odkritje, da proteini, ki 19

27 vežejo CaM, inhibirajo aktivnost encima [29]. S spremembami v domeni za vezavo kalmodulina se spreminja občutljivost različnih izoform NOS na kalcij. Tako imata izoformi nnos in enos mnogo višje zahteve po Ca 2+ od inos. Vezava CaM poveča hitrost prenosa elektrona iz NADPH na reduktazo in na druge prejemnike elektronov, na primer citokrom C [31]. Poleg razlike v zahtevah po kalciju se izoforme NOS razlikujejo še po polipeptidnem vložku, ki ga predstavlja 40 do 50 aminokislin v FMN domeni. Le-ta je prisoten pri nnos in enos, pri inos pa ga ni. Polipeptidni vložek lahko inhibira vezavo kalmodulina in zmanjša aktivnost encima. Tako predstavlja avtoinhibitorni kontrolni element in ga mora kompleks Ca 2+ /CaM ob vezavi izpodrniti. Vložek predstavlja potencialno mesto fosforilacije in vključuje prepoznavne dele za protein kinazo C (PKC). Fosforilacija ali defosforilacija lahko vplivata na afiniteto med enos in CaM [29]. Interakcija enos s kaveolinom-1 Kaveolinski proteini so proteini površja kaveol. S prvimi raziskavami so ugotovili, da je enos lokaliziran v kaveolah (mikrodomene v plazmalemi), vendar lahko enos najdemo tudi v presledkovnih stikih. Na osnovi rezultatov nekaterih študij so raziskovalci menili, da je enos lokaliziran na Golgijevemu aparatu, drugi pa, da je lokaliziran na celični membrani [29]. Z imunooznačevanjem prašičje koronarne arterije so ugotovili, da je enos povezan tako s plazmalemo kot z Golgijevim aparatom. Ni pa popolnoma znano, v katerih delih je enos aktivna v nestimulirani celici za produkcijo bazalne koncentracije NO [31]. V endotelijskih celicah se enos veže s kaveolinom-1, v srčnih celicah pa je povezana s kaveolinom-3. Vezava kaveolina-1 na enos naj bi zavirala vezavo CaM in tako inhibirala aktivnost encima. Kaveolin-1 se veže na reduktazno domeno enos, na katero bi se drugače vezal CaM, in tako prepreči, da bi CaM oddal elektrone podenoti hema. Tako je inhibirana sinteza NO [29]. Drugi modulatorji funkcij enos Trajanje Ca 2+ signala je bistveno krajše od trajanja produkcije NO. Razen sprememb koncentracije kalcija bi naj aktivnost enos regulirali še številni drugi mehanizmi, npr. 20

28 interakcija enos z določenimi proteini, interakcija z membranskimi fosfolipidi in fosforilacija. Ugotovili so na primer, da je v celičnih kulturah endotelijskih celic bradikinin povečal fosforilacijo enos na serinu. Ta fosforilacija, ki jo inducira bradikinin, je od kalcija odvisen pojav. Lahko jo inhibirajo agonisti kalmodulina ali znižana koncentracija zunajceličnega kalcija [29]. Serinska fosforilacija enos bi lahko bila povezana z negativnim vplivom PKC na aktivnost enos. Inhibicija PKC namreč znatno poveča izločanje NO, ki ga inducirajo agonisti. Od kalcija neodvisna aktivacija enos Endotelijska NOS je od Ca 2+ /CaM odvisen encim, vendar pa je bila bazalna aktivnost prikazana pri zelo nizkih koncentracijah kalcija (okrog 10 nm). To pomeni, da se pomemben del NO proizvede v nestimuliranih endotelijskih celicah. Za dosego maksimalne aktivnosti enos je potrebna vezava Ca 2+ /CaM kompleksa, vendar pa so novejše biokemijske študije še bolj okrepile domnevo, da lahko enos proizvaja NO navidez neodvisno od kalcija. Aktivacijo enos lahko povzročijo tudi drugi dražljaji, brez povišanja intracelularne koncentracije kalcija. To so v glavnem fizični stimuli, npr. strižna deformacija in izometrično raztezanje, pa tudi rastni faktorji (npr. žilni endotelijski rastni faktor (VEGF; ang vascular endothelial growth factor)in nekateri hormoni (npr. estrogen). Endotelijska NOS je v prisotnosti etilendiamintetraocetne kisline ali EDTA, ki se uporablja v tkivnih kulturah kot reagent, ki veže kalcij, in etilen glikol tetraocetne kisline ali EGTA, ki ima prav tako visoko afiniteto za kalcij, neaktivna [29]. Neaktivnost enos kaže na to, da do njene aktivacije sicer vodita dve popolnoma ločeni poti, vendar ima v obeh primerih kalcij pomembno vlogo. 4.3 Uravnavanje bioaktivnosti NO Dušikov oksid je izjemno lipofilna molekula, tako lahko prehaja iz endotelijskih celic v gladke mišične celice z difuzijo. NO reagira z različnimi tarčami, in ima različne učinke (slika 11). V gladki mišični celici se veže na gvanilat ciklazo na železo v predelu hema, s tem spremeni konformacijo encima ter ga tako aktivira. Aktivirana gvanilat ciklaza proizvaja ciklični gvanozin 3',5'-monofosfat (cgmp), ki preko različnih mehanizmov (polnjenje intracelularnih shramb, aktivacija na kalcij občutljivih kalijevih kanalov...) zniža koncentracijo kalcija v gladki mišični celici in posledično povzroči zmanjšano 21

29 raven kontrakcije gladke mišične celice. Na podoben način NO aktivira gvanilat ciklazo v trombocitih in tako inhibira združevanje in zlepljenje trombocitov [32]. Interakcije med dušikovim oksidom, njegovimi metaboliti in drugimi prostimi radikali so kompleksne in jih je težko kategorizirati. Možne interakcije so prikazane na sliki 11. NO reagira s prehodnimi kovinami (M) in spremeni njihovo valenco (x). Reakcija NO s superoksidom ( ) je hitra, pri njej nastaja peroksinitrit. Peroksinitrit je močna oksidativna spojina, ki lahko doprinaša k poškodbam tkiva pri akutni okvari pljuč in k mikrobiocidni aktivnosti NO. Pri reakciji kisika z NO v raztopini nastaja neaktiven metabolit nitrit ( ), če pa reagira kisik s plinasto obliko NO, nastane strupen plin NO 2 (dušikov dioksid). NO reagira tudi s tiolno skupino (R-SH) pri čemer nastajajo nitrosotioli (RS-NO), ki imajo podobne biološke učinke kot NO, vendar imajo nitrosotioli daljši razpolovni čas. Ker lahko NO reagira z različnim tarčami, ni odvisen samo od enega receptorja ali cilja za izvedbo svojih fizioloških učinkov. Raznolikost reakcij z NO prispeva h kompleksnosti učinkov, ki jih kot pogosta signalna molekula povzroča NO [28]. Slika 11: Kemijske reakcije NO z različnimi tarčami [31] Interakcija NO z drugimi substancami in sekundarnimi prenašalci signalov lahko pomembno vpliva na regulacijo fizioloških odzivov. Prisotnost rdečih krvnih celic v bižini mesta sinteze NO in hitra vezava NO na oksigeniran in deoksigeniran hemoglobin kaže recimo na to, da bo znaten del NO, ki se proizvede v endotelijskih celicah, uničen v krvi [5]. Pri reakciji NO s skupino hem hemoglobina se tvori methemoglobin, NO pa se na ta način razgradi. Dejstvo je, da je hemoglobin vezan v notranjosti rdeče krvne celice in da je koncentracija rdečih krvničk tik ob endotelijskih 22

30 celicah manjša, kar omejuje interakcijo NO s hemoglobinom. Del v endoteliju proizvedenega NO pa kljub temu difundira do gladke mišične celice, kjer sproži vazorelaksacijo. Fiziološki vplivi NO in interakcije med NO in kisikom lahko znatno vplivajo na dostopnost obeh molekul. Preko vpliva NO na vazorelaksacijo se spreminja pretok krvi in s tem transport kisika po telesu. Sinteza NO, ki jo katalizira NOS, pa je odvisna od koncentracije kisika. NO regulira tudi dihalno verigo v mitohondrijih in porabo kisika v tkivu preko reverzibilne inhibicije citokrom oksidaze [5]. Reakcija med superoksidom in dušikovim oksidom je ključna v fiziologiji in patologiji dušikovega oksida. Pri reakciji med in NO se tvori peroksinitrit (ONOO - ) (slika 12), ki je ključen za zagotavljanje ravnovesja med NO in reaktivnimi kisikovimi spojinami (ROS) in reaktivnimi dušikovimi spojinami (RNS). Reaktivne dušikove spojine lahko povzročijo oksidativni stres, celično smrt in poškodbe tkiva, po drugi strani pa je NO močan antioksidant in je znižanje njegove koncentracije povezano z mnogimi patološkimi stanji, kot so kardiovaskularne bolezni. NO je edini mediator, ki lahko»tekmuje«s superoksid dismutazo (SOD) za in tako je prisotnost NO pomembna determinanta nivoja superoksida, vendar pa tudi prisotnost vpliva na nivo NO (slika 12). Ohranjanje bioaktivnosti NO v krvnem obtoku opisujeta dve hipotezi [5]. Stamler in sodelavci (1999) so pokazali, da hemoglobin ne pretvarja NO ireverzibilno v nitrat, temveč ga v bistvu ohranja z vezavo na nezasedeno skupino hema. NO se tako lahko tudi sprosti s hemoglobina. To predstavlja mehanizem reguliranega izpusta NO iz rdečih krvnih celic na območjih velike porabe kisika, ki tako povzroči širjenje žil in poveča pretok krvi [33]. Po drugi, novejši hipotezi bi naj bil NO shranjen v krvnem obtoku kot nitrit in bi naj imel hemoglobin pomembno vlogo pri redukciji nazaj v NO. V skladu s tem mehanizmom hemoglobin stimulira izpust NO pod hipoksičnimi pogoji preko hitre pretvorbe nitrita do NO [5]. Vendar pa noben od teh dveh mehanizmov ne razloži mehanizma, ki bi opisal transport NO, ki se sprosti iz eritrocitov, do gladke mišične celice. Teoretične analize kažejo na to, da bi prosti NO, ki bi nastal v notranjosti eritrocita, takoj reagiral s hemoglobinom. Poleg tega pa lahko takšen NO povzroči le pikomolarne spremembe koncentracije NO v gladkih mišičnih celicah. 23

31 Slika 12: a) Dušikov oksid je visoko reaktivni plin, ki lahko reagira s superoksidnimi anioni, pri čem se tvori peroksinitrit (ONOO - ). b) Superoksidne ione ( ) SOD razgradi do vodikovega peroksida (H 2 O 2 ). c) Vodikov peroksid se razgradi do vode (H 2 O) in kisika (O 2 ) [5]. 4.4 Aktivacija gvanilat ciklaze NO je intracelularna signalna molekula, ki lahko prosto difundira med celicami in vpliva na širok spekter fizioloških mehanizmov. Mehanizmi učinkov NO na ciljne molekule in posledično izzvane spremembe v celici so še vedno dokaj slabo opisani. Topna gvanilat ciklaza (sgc; ang. soluble gunilyl cyclase) predstavlja najpomembnejši celični receptor za NO. Aktivacija sgc poviša koncentracijo cgmp v celici, ki ima širok spekter fizioloških učinkov. Encim topna gvanilat ciklaza (sgc) je heterodimer, sestavljen iz ene α in ene β podenote. V človeških tkivih sta bili zaenkrat odkriti dve izoformi (α1β1, α2β1) [5]. Večina raziskav poteka na izoformi α1β1. Občutljivost encima na NO je povezana z ostankom histidina 105 (His-105) na β1 podenoti. NO se veže na hem, ki je kovalentno vezana na β1 podenoto gvanilat ciklaze, kar sproži konformacijsko spremembo encima. Ob vezavi NO pride do aktivacije C-terminalne katalitske domene, ki katalizira reakcijo sinteze cgmp iz GTP. Aktivacija sgc, ki jo sproži NO, poteka v dveh korakih. V prvem koraku se NO veže na hem skupino. V drugem koraku se prekine vez s histidinom na β1 podenoti, kar povzroči povečanje katalitske aktivnosti. Ciklični gvanozin monofosfat, ki nastaja pri aktivaciji gvanilat ciklaze, je posrednik NO signalizacije v gladki mišični celici in se po nastanku lahko veže z receptorskimi proteini v celici. Ti proteini so od cikličnih nukleotidov odvisne protein kinaze, ionski kanali in ciklične nukleotid fosfodiesteraze. Preko različnih mehanizmov regulirajo koncentracijo intracelularnega kalcija, na primer preko aktivacije kalijevih kanalov, ki jih aktivira kalcij (K Ca kanali), regulacije kalcija v sarkoplazemskem retikulumu in 24

32 inhibicije nastanka IP 3 [34]. Vezava NO vodi v najmanj 200-kratno povečanje aktivnosti gvanilat ciklaze. 5 SIGNALNI MEHANIZMI V GLADKI MIŠIČNI CELICI ARTERIJE Ciklični gvanozin monofosfat (cgmp) se sintetizira iz GTP, reakcijo katalizira gvanilat ciklaza. Signalizacija preko cgmp je en izmed najbolje raziskanih celičnih signalnih mehanizmov. Raziskave in opisi glavnih komponent teh signalnih poti so se začeli že v 70-ih letih prejšnjega stoletja [29, 35]. 5.1 Signalizacija v procesu vazokonstrikcije Ciklični GMP je posrednik NO signalizacije v celici predvsem zaradi velike afinitete NO za topno gvanilat ciklazo. Po nastanku v celici lahko cgmp hidrolizirajo ciklične nukleotid fosfodiesteraze ali pa se veže z eno od treh vrst intracelularnih receptorskih proteinov. Ti proteini so od cikličnih nukleotidov odvisne protein kinaze (tudi od cgmp odvisna protein kinaza - PKG), ionski kanali (predvsem nespecifični kationski kanali) in ciklične nukleotid fosfodiesteraze [29]. Od cgmp odvisna protein kinaza (PKG) Encim PKG, od cgmp odvisna protein kinaza, je serin/treonin kinaza. Sestavlja jo C- terminalna katalitska domena, ki je homolgna z drugimi kinazami. V strukturi so prisotni še lizin, vezavno mesto ATP in mesto fosforilacije. PKG lahko aktivirajo tako nizke koncentracije cgmp kot tudi visoke koncentracije cikličnega adenozin monofosfata (camp). Koncentracije, potrebne za aktivacijo, so odvisne od izoforme in stanja fosforilacije. Vse izoforme PKG so homodimere, pri človeku so bile prepoznane izoforme Iα, Iβ in II. Aktivacijo so večinoma preučevali pri tipu I. Tip Iα je izražen v vseh gladkih mišičnih celicah, predvsem pa v mišičnih celicah sapnika in gladkih mišičnih celicah žil. Hkrati je tudi glavna izoforma, izražena v krvnih ploščicah, malih možganih in pljučih. Tip Iβ je v višjih koncentracijah izražen v gladkih mišičnih celicah, vendar večinoma nevaskularnih mišičnih celicah (maternica, črevesje). PKG tipa II je omejena na epitelne celice črevesja, hondrocite in določene dele možganov. V mnogih tipih celic ni izražena nobena izoforma PKG, na primer v celicah skeletnih mišic in eritrocitih. 25

33 Proces aktivacije PKG vključuje vezavo cikličnih nukleotidov in indukcijo fosforilacije serina in treonina. Na PKG obstajata dve vezavni mesti za cgmp počasno vezavno mesto (nizka hitrost odcepitve cgmp) z visoko afiniteto za cgmp in hitro vezavno mesto z nizko afiniteto za cgmp. Bazalni nivoji cgmp v celici so reda velikosti μmol/l, tako lahko sklepamo, da je v mirovnem stanju zasedeno samo počasno vezavno mesto. Hitro vezavno mesto tako predstavlja stikalo, ki inducira maksimalno aktivacijo encima. PKG lahko aktivirajo tudi visoke koncentracije camp, ki pa se primarno veže na počasno vezavno mesto PKG-I. Afiniteta encima za camp se z avtofosforilacijo poveča. Zato lahko pričakujemo, da se bo camp (pri fizioloških nivojih) vezal na avtofosforiliran PKG. Na trakovih mišičnega tkiva koronarne arterije, je bila demonstrirana tudi navzkrižna aktivacija PKG [36]. Nivoji camp so v večini celic 10 do 20-krat višji od nivojev cgmp. Tako lahko camp tudi sam, brez povišanja cgmp, sproži aktivacijo PKG. Koncentracija PKG se od tkiva do tkiva razlikuje, kar kaže na fiziološko regulacijo encima. Razumevanje fiziološke vloge PKG izhaja iz identifikacije substratov, na katere deluje kot encim. V primeru gladke mišične celice se veže na IP 3 receptorje tipa I na sarkoplazemskem retikulumu, s čimer uravnava izpust Ca 2+ iz SR. S fosforilacijo fosfolambana povečuje črpanje Ca 2+ nazaj v SR. Z vezavo na α podenoto s kalcijem rekuliranih kalijevih kanalov (K Ca kanalov) uravnava pritok K + in vpliva na hiperpolarizacijo membrane gladke mišične celice [29]. Ciklični gvanozin monofosfat (cgmp) lahko poleg PKG aktivira tudi od camp odvisno protein kinazo (PKA), vendar pa nivoji cgmp redko dosežejo dovolj visoke vrednosti, da bi prišlo do tega pojava. V raziskavah so uspeli prikazati ta primer v dveh patofizioloških stanjih [37, 38]. V obeh primerih so pokazali, da lahko močno povišanje cgmp v nedotaknjeni celici aktivira PKA. Zaenkrat še ni bilo dokazano, če je to dejanski fiziološki pojav. Ena izmed težav pri prepoznavaju vloge PKG in PKA je pomanjkanje specifičnih in farmakološko dobro definiranih inhibitorjev. Dve skupini spojin domnevno inhibirata PKG tipa I: izokvinolinsulfonamidne spojine in fosforotiati [29]. Izokvinolinsulfonamidne spojine so kompetitivni inhibitorji za vezavo ATP na katalitsko stran kinaz, predstavniki so H-spojine in KT spojine. Fosforotiati pa so 26

34 kompetitivni inhibitorji za vezavo cikličnih nukleotidov, predstavniki so Rp stereoizomere cgmp fosforotiatov. Pri inkubaciji s kinazami KT spojine in Rp stereoizomere cgmp fosforotiatov bolj inhibirajo PKG kot PKA [29]. 5.2 Signalizacija v procesu vazodilatacije Zdravila, ki vsebujejo nitrovazodilatatorje, na primer nitroglicerin, so že več kot stoletje v uporabi za zdravljenje angine pektoris. Povzročijo periferno vazodilatacijo, še posebej širijo vene, kar zmanjša prednapetost ali diastolični volumen srca. Zmanjšanje prednapetosti povzroči manjšo porabo kisika same srčne mišice, kar je ključnega pomena za zdravljenje angine pektoris. Vloga cgmp v vazodilataciji je dobro potrjena na treh nivojih: - zdravila z NO, ki povišajo produkcijo cgmp, so vazodilatorji, - vazodilatorni učinek imajo tudi analogi cgmp in inhibitorji cgmp fosfodiesteraze, ki razgrajuje cgmp, - specifični inhibitoji sgc preprečijo od NO odvisno relaksacijo [29]. Vloga PKG pri regulaciji intracelularnega kalcija Vpliv NO na vazodilatacijo je znan, slabše pa so poznani natančni mehanizmi, v katere sta vključena cgmp in PKG, preko katerih NO privede do vazodilatacije. Prva odkritja na tem področju so vsa kazala na to, da aplikacija zdravil z NO, analogov cgmp in encima PKG (če ga dovajamo v gladko mišično celico) vsi znižajo nivo kalcija v celici [39, 40, 41]. Ker je Ca 2+ ključen pri aktivaciji kinaz lahkih verig miozina (MLCK), je bila ta najdba izjemno pomembna. Prepoznani so trije pomembnejši mehanizmi, preko katerih PKG vpliva na znižanje koncentracije kalcija v vaskularni gladki mišični celici (slika 13): - PKG aktivira od Ca 2+ odvisne kalijeve kanale (K Ca ), kar vodi v hiperpolarizacijo in zapiranje napetostno reguliranih kalcijevih kanalov (L-tip Ca 2+ kanali), preko katerih Ca 2+ vdira preko celične membrane v citoplazmo; - poviša hitrost črpanja kalcija v intracelularne shrambe (SR) in - inhibira nastanek inozitol monofosfata in posledično inozitol 3-fosfata (IP 3 ), ki stimulira odprtje kanalov na intracelularni shrambi za kalcij (SR). Kalijevi kanali, ki jih aktivira kalcij (K Ca ), so v gladki mišični celici sestavljeni iz α in β podenote. Podenota α je ključna pri formaciji pore in je dejanska komponenta kanala. 27

35 Podenota β predstavlja regulatorni protein kanala [29]. Aktivacija K Ca kanalov bi naj vodila do relaksacije mišice [42, 43]. PKG povzroči direktno fosforilacijo kanala, kar vodi do višje stopnje odprtosti kanala [44, 45]. V osemdesetih in devetdesetih letih prejšnjega stoletja so pokazali, da PKG katalizira fosforilacijo proteinov na SR, še posebej proteina fosfolambana. Fosforilacija fosfolambana regulira ATPazo sarkoplazemskega retikuluma (SERCA) črpalko za kalcij (slika 13). Ko pride do fosforilacije, se fosfolamban odcepi od SERCA, kar pohitri črpanje kalcija v SR. Drugi mehanizem, preko katerega PKG znižuje koncentracijo Ca 2+, je fosforilacija IP 3 receptorja tipa I v membrani sarkoplazemskega retikuluma [29]. Slika 13: Možni mehanizmi delovanja od cgmp odvisne protein kinaze na tokove K + in Ca 2+ v vaskularni gladki mišični celici. Raziskovanje je trenutno usmerjeno v vlogo signalne poti NO-cGMP pri regulaciji fosfolipaze C in nastanku sekundarnega prenašalca IP 3 ter diacilglicerola (DAG). Ti sekundarni prenašalci posredujejo signale v različnih celicah in tkivih. PKG in cgmp bi naj inhibirala nastanek IP 3, ki bi ga sprožili agonisti [46, 47]. Inhibicija produkcije IP 3 predstavlja mehanizem za znižanje kontrakcije gladkih mišic, ki jo izzovejo agonisti. Vendar točen mehanizem, preko katerega aktivacija PKG inhibira nastanek IP 3 in DAG, ni popolnoma pojasnjen. Ciklični nukleotidi in protein kinaze regulirajo aktivnost L-tipa kalcijevih kanalov. V mnogih primerih so ti efekti povezani z aktivacijo K Ca kanalov in posledično 28

36 hiperpolarizacijo, vendar so bili opisani tudi direktni učinki. Vloga PKG pri regulaciji L-tipa kalcijevih kanalov je zelo pomembna [29], vendar biokemijski mehanizmi, po katerih bi od PKG odvisna fosforilacija vplivala na funkcije kanalov, še niso znani. Vloga PKG pri regulaciji preobčutljivosti na kalcij Preobčutljivost na kalcij je pojav, ko pride do razvoja sile v mišici pri nizki koncentraciji kalcija v celici [48]. Tehnologija za določanje koncentracije intracelularnega kalcija je v zadnjih desetletjih precej napredovala. Tako so lahko opazovali, da lahko pride do kontrakcij, ki jih inducirajo agonisti, pri majhnih povišanjih koncentracije kalcija v primerjavi s tistimi, do katerih pride zaradi depolarizacije [29]. Kontraktilno aktivnost lahko dosežemo pri koncentracijah kalcija v citosolu, ki so blizu mirovnim koncentracijam. Tako mora obstajati mehanizem, ki poveča razvoj sile že pri nizkih koncentracijah kalcija [29]. Regulacija fosfataze lahkih verig miozina (MLCP) Pri fosforilaciji lahkih verig miozina (MLC; ang. myosin light chains) je vljučitev fosfata v serin-19 rezultat uravnotežene aktivnosti kinaze (MLCK) in fosfataze (MLCP) MLC. MLCK se veže s kompleksom Ca 2+ -kalmodulin in postane aktivna. PKG in predvsem PKA lahko fosforilirata MLCK in zmanjšata njeno aktivnost. Aktivnost MLCP je odvisna predvsem od aktivnosti katalitske podenote encima, ki pa jo s fosforilacijo regulirajo od PKC odvisni encimi in RHO kinaza [49]. Zaenkrat večina teh mehanizmov še ni podrobno pojasnjena. Somlyo in sodelavci so na primer pokazali, da PKG katalizira fosforilacijo proteina telokina, ki pospešuje defosofrilacijo MLC [49]. Tako fosforilacija telokinina s PKG predstavlja novejši in potencialno zelo pomemben mehanizem regulacije za zmanjšanje občutljivosti za kalcij pri kontrakciji. 6 MATEMATIČNI MODELI 6.1 Model katalize enos in produkcije NO Vse izoforme NO sintaz so homodimeri. To so proteini, ki so sestavljeni iz dveh enakih podenot, ki med sabo nista kovalentno vezani. Vsaka podenota je sestavljena iz reduktazne domene, ki vsebuje FAD in FMN, ter oksigenazne domene, ki vsebuje H 4 B in hem (glej opis v poglavju 4.2). Vezava od Ca 2+ odvisnega kalmodulina (CaM) omogoča prenos elektronov iz flavinov na hem, kar sproži sintezo NO. S kinetičnim 29

37 modelom katalize NO sintaze, ki je prikazan na sliki 14, je v desetih korakih predstavljena poenostavljena sekvenca za opis obeh korakov sinteze NO - hidroksilacije arginina do N ω -hidroksi-l-arginina in oksidacije NOHA do citrulina in sprostitev NO (slika 9). Železov hem-no kompleks nastane pred izpustom prostega NO. Regeneracija encima poteka po dveh poteh, vendar se samo v enem od teh primerov sprošča NO [50]. Kinetični model je enak za vse tri izoforme NO sintaze (enos, inos in nnos), vendar je nnos edina izoforma, kjer je kopičenje in nastanek železovega heme-no kompleksa hiter in stabilen proces. Pri enos (in inos) pride le do delnega kopičenja, ki traja dlje časa kot pri nnos. Formacija hem-no kompleksa je pri enos povezana z zunanjo koncentracijo NO (njegov nastanek lahko inhibira oksihemoglobin). Slika 14 shematsko prikazuje kinetični model. Številke označujejo posamezne korake reakcije in hkrati predstavljajo indekse hitrostnih konstant (k 1 k 10 ), katerih vrednosti so zbrane v tabeli 1 in so povzete po Santoliniju in sod. [50]. Slika 14: Kinetični model katalize NO sinteze in produkcije NO, povzet po Santoliniju in sod. [50]. Koraki 1 3 na sliki 14 predstavljajo hidroksilacijo arginina do N ω -hidroksi-l-arginina (NOHA), kar opišemo z enačbami: (1), (2) in, (3) 30

38 kjer k 1, k 2, k 7 in k 10 predstavljajo hitrostne konstante za korake, ki so označeni na sliki 16, [NADPH] 0 in [O 2 ] 0 sta začetni koncentraciji NADPH in kisika, sekvenca pretvorbe Fe(III) v Fe(II) in dalje v Fe(II)O 2 opisuje spremembe hema pri hidroksilaciji arginina (slika 15). Reakcijo poganja NADPH, ki v prvem koraku povzroči prenos elektrona iz reduktaznih flavinov na heme (slika 14, korak 1 in slika 15, korak 1) (glej poglavje 4.2.1). Sledi vezava kisika in tvorba kompleksa Fe(II)O 2 (slika 14, korak 2 in slika 15, korak 2). Fe(II)O 2 prejme elektron od H 4 B, sledi pretvorba arginina v NOHA. Pretvorba je hitra, zato vmesni korak (slika 15, sivo območje) ni označen na sliki 14. Slika 15: Hidroksilacija arginina [51] Fe(II)NO nastane kot produkt oksidacije NOHA. Korak 7 predstavlja regeneracijo encima in direktno sprostitev NO, korak 8 pa predstavlja redukcijo Fe(III) hem-no kompleksa v Fe(II) hem-no kompleks, čemur sledi korak 9 (počasna sprostitev NO) ali korak 10 (oksidacija hem-no kompleksa) (slika 14). Z enačbami, (4) in, (5) (6) so opisani koraki 4 6 (slika 14), ki predstavljajo oksidacijo NOHA do citrulina in železovega hem-no kompleksa. V tem primeru sekvenca pretvorbe Fe(III)* v Fe(II)* in naprej v Fe(II)O 2 * opisuje spremembe hema pri oksidaciji NOHA do citrulina in Fe(III)NO kompleksa, konstante k 3, k 4, k 5 in k 6 predstavljajo hitrostne konstante za posamezne korake (slika 14). 31

39 Spreminjanje koncentracije NO opišemo z enačbo, (7) spreminjanje koncentracije citrulina pa z enačbo. (8) Spreminjanje koncentracije Fe(III)NO in Fe(II)NO opišemo z enačbama (9) in, (10) V procesu oksidacije heme-no kompleksa se sprošča nitrat. Spreminjanje koncentracije le-tega opišemo z enačbo, (11) kjer hitrostna konstanta k 10 predstavlja hitrost oksidacija heme-no kompleksa. Enačbi (12) in (13) opisujeta porabo NADPH in O 2 v opisanem modelu. Zaradi difuzije v celico je dejanska koncentacija O 2 konstantna, NADPH pa je produkt metabolizma, ki ga celica tudi sproti tvori. Začetna koncentracija O 2 ( ) je 140 μm, začetna koncentracija NADPH ( je 40 μm [50]. 32

40 Tabela 1: Parametri kinetičnega modela katalize enos [50]. Parameter Vrednost k 1 6,5 x 10 4 M -1 s -1 k 2 9 x 10 5 M -1 s -1 k 3 26 s -1 k 4 6,5 x 10 4 M -1 s -1 k 5 9 x 10 5 M -1 s -1 k 6 26 s -1 k 7 5 s -1 k 8 6,5 x 10 4 M -1 s -1 k 9 1 x 10-4 s -1 k 10 1,3 x 10 3 M -1 s Model aktivacije gvanilat ciklaze Topna gvanilat ciklaza (sgc; ang. soluble guanylat cyclase) predstavlja tarčo dušikovega oksida v gladki mišični celici. Koncentracija NO, ki je potrebna za aktivacijo sgc, ostaja kontroverzna. Koncentracija za polovično aktivnost encima močno variira in znaša od 1 do 250 nm [5]. Aktivacija encima poteka v dveh korakih (slika 15). Rezultat začetne vezave NO na sgc je delna aktivacija encima z nastankom vmesnega produkta - nitrozilnega kompleksa E 2. Nadaljna pretvorba do nitrozilnega kompleksa E 3 lahko poteka odvisno ali neodvisno od NO. Condorelli je mehanizem prilagodil in vključil odcepitev NO (s hitrostno konstanto k D ) od kompleksa E 3, s čimer je upoštevan še efekt razgradnje NO (npr. zaradi hemoglobina, mioglobina in tiolov) [34]. Analiza kinetičnega modela kaže, da so že nizke koncentracije NO dovolj velike za aktivacijo encima [5]. Aktivacija C-terminalne katalitske domene, do katere pride ob vezavi NO, katalizira sintezo cgmp iz GTP. O različnih vplivih in mehanizmih relaksacije GMC, ki jih sproži cgmp, sem več napisala v poglavju 5. Natančna vrednost koncentracije NO v celici ni znana. Vendar lahko vseeno pojasnimo vazodilatacijo, saj je v tem področju koncentracije NO dosežena polovična aktivnost encima sgc. Z eksperimentom izmerjene koncetracije NO v stenah žile so v območju med 300 in 600 nm [52], v nekaterih primerih presežejo 1 μm [53]. Pri takšnih koncentracijah bi moral biti encim sgc popolnoma aktiven in tako NO ne bi mogel prispevati k regulaciji mišičnega tonusa. Visoke vrednosti, izmerjene v stenah žile, bi lahko bile rezultat prispevka NO iz neendotelijskih virov. 33

41 Na sliki 16 je prikazan poenostavljen mehanizem vezave NO (slika 16, polne črte), ki so ga predstavili Zhao in sodelavci [54]. V prvi fazi se NO veže na osnovno obliko sgc, pri tem nastane nitrozilni kompleks E 2. Le-ta se lahko pretvori v nitrozilni kompleks E 3 preko ene izmed dveh poti, pri čemer se prekine vez med histidinom in hem. Od NO odvisna pot je ireverzibilna in jo karakteriziramo s konstanto k 3 (slika 16). Condorelli in George [34] sta drugo, od NO neodvisno pot, opisala kot reverzibilno in jo karakterizirala s konstantama k 2 in k -2. Vključila sta tudi odcepitev NO od E 3 oblike sgc (slika 16, črtkane črte). Odcepitev NO je opisana z dvema konstantama k -2 in k D. Konstanta k -2 opiše odcep NO v primeru, ko ni prisotnih kofaktorjev. S parametrom k D pa upoštevata, da NO vežejo uničevalci (npr. hemoglobin). Tako domnevata, da se NO, ki se odcepi po poti k D, hitro razgradi. Iz slike 16 lahko vidimo tudi, da vse oblike sgc (E 1, E 2 in E 3 ) katalizirajo pretvorbo GTP v cgmp, vendar z različnimi hitrostmi. Slika 16: Kinetični mehanizem aktivacije topne gvanilat ciklaze in nastanek cikličnega gvanozin monofosfata (cgmp) [5]. Condorelli in George sta sistem obravnavala v ravnovesju in iz tega izpeljala izraz za hitrost produkcije cgmp v odvisnosti od koncentracije NO. Enačba (14) ocenjuje hitrost nastanka cgmp ( ) v mirovnem stanju, za dano koncentracijo NO ( ) v gladki mišični celici, pri čemer so parametri definirani na naslednji način s hitrostnimi konstantami:,,,,, in. Vrednosti parametrov so zbrane v tabeli 2. 34

42 Dinamiko nastanka cgmp pri spreminjanju prikazuje enačba, (15) kjer je začetna relativna hitrost nastanka cgmp, pa je hitrost nastanka cgmp v mirovnem stanju (en. 14). Konstanta predstavlja kinetično konstanto prvega reda za aktivacijo in jo lahko približno določimo iz enačbe, (16) v kateri predstavlja polovični čas aktivacije, C NO je koncentracija NO, k 3 je hitrostna konstanta (slika 16), s konstanto k D pa je upoštevan vpliv uničevalcev NO. Vrednosti k D so med 0 (vpliv uničevalcev ni upoštevan) in 0,2 s -1. Tabela 2: Parametri modela aktivacije gvanilat ciklaze [34] Parameter Vrednost k 1 2,0 s -1 k ,0 nm -1 s -1 k 2 0,1 s -1 k -2 0,002 s -1 k 3 0,003 nm -1 s -1 k D 0,01 s -1 γ GCB 0,004 γ GC6 0,5 6.3 Dinamika kalcija v gladki mišični celici in v endoteliju Dinamiko gladke mišične in endotelijske celice opišemo z modelom, ki temelji na teoretičnih zasnovah Koenigsbergejeve in sod. [55]. Model sestavlja 9 sklopljenih diferencialnih enačb, ki opisujejo celične mehanizme, ki urejajo kalcijevo dinamiko in membranski potencial na celični membrani, in to tako v gladki mišični celici kot v endotelijski celici. Spremenljivke v modelu za opis gladke mišične celice označimo z indeksom i. Nastopa pet spremenljivk: koncentracija kalcija v citosolu, koncentracija kalcija v sarkoplazemskem retikulumu, membranski potencial celice, delež odprtih kalijevih kanalov in koncentracija IP 3, ki jo označimo z. Podrobnejše opise in vrednosti parametrov lahko bralec najde v članku [55]. 35

43 Spreminjanje koncentracije kalcija v citosolu opišemo z enačbo (17) kjer so: - tok kalcija iz shramb v sarkoplazemskem retikulumu skozi kanale, ki so občutljivi na IP 3 (en. 26); - tok Ca 2+ v sarkoplazemskem retikulumu preko Ca 2+ -ATPaz (SERCA) (en. 27); - tok, ki predstavlja izpust kalcija iz sarkoplazemskega retikuluma, ki ga inducira kalcij preko CICR mehanizma (en. 28); - tok aktivnega črpanja kalcija preko celične membrane (en. 29); - pasivni tok Ca 2+ iz sarkoplazemskega retikuluma (en. 30); - tok kalcija v citosol skozi napetostno regulirane kalcijeve kanale (en. 31) in - tok kalcija skozi izmenjevalce Na + in Ca 2+ ionov na celični membrani (en. 32). Vsi tokovi in njihove smeri, ki vplivajo na spreminjanje koncentracije kalcija v citosolu GMC so prikazani na sliki 17. Slika 17: Tokovi kalcija, ki vplivajo na koncentracijo kalcija v citosolu gladke mišične celice. Z enačbo (18) opišemo spreminjanje koncentracije kalcija v sarkoplazemskem retikulumu. Tokovi so enaki kot zgoraj, le da so nasprotno usmerjeni. Na spreminjanje membranskega potenciala, ki ga opišemo z enačbo: 36