UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE VPLIVI STRIŽNE NAPETOSTI TOKA KRVI NA ENDOTELIJ KAROTIDE. (Magistrsko delo)

Transcription

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE VPLIVI STRIŽNE NAPETOSTI TOKA KRVI NA ENDOTELIJ KAROTIDE (Magistrsko delo) Maribor, 2017 Manja Sluga

2

3 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE Mentor: prof. dr. Milan Brumen Somentor: doc. dr. Aleš Fajmut

4

5 ZAHVALA Iskreno se zahvaljujem mentorju prof. dr. Milanu Brumnu in somentorju doc. dr. Alešu Fajmutu za strokovno pomoč, predano znanje in konstruktivne nasvete pri izdelavi magistrskega dela. i

6

7 POVZETEK V magistrskem delu najprej sistematično predstavimo poznane mehanizme zaznavanja strižne napetosti, njihov vpliv na endotelij karotide in drugih arterij ter vlogo poznanih mehanizmov na produkcijo dušikovega oksida (NO). Ključni mehanosenzorni kompleksi, ki se aktivirajo ob spremembah strižne napetosti in ki sprožajo različne signalne poti v endotelnih celicah, so ionski kanali, receptorji tirozin kinaze, G-proteini, kaveole, adhezijski proteini, citoskelet, glikokaliks in primarne migetalke. Večjo pozornost v nalogi posvetimo tudi opisom mehanosenzornega kompleksa medceličnih stikov, ki mu je v zadnjem času pripisana vedno večja vloga pri mehanotransdukciji strižne napetosti in aktivaciji anti-aterosklerotičnih signalnih poti. V nadaljevanju obravnavamo matematični model, ki kot mehanotransduktorje vključuje ionske kanale, integrine in receptorje, povezane z G-proteini. Model ovrednotimo z namenom ugotavljanja njegove zmožnosti za reprodukcijo relevantnih izmerjenih podatkov produkcije NO. Ugotovitve primerjamo še z drugim modelom, ki upošteva vpliv zgolj dveh mehanoreceptorjev (integrinov in receptorjev, povezanih z G-proteini), toda podrobneje opisuje vplive kompleksa kalcij/kalmodulin (Ca 2+ /CaM), encima protein kinaza B (Akt) ter stresnega proteina (Hsp90) na aktivnost encima endotelijska sintaza dušikovega oksida (enos). Za razliko od prvega modela drugi ne vključuje inhibitornih vplivov encima protein kinaza C (PKC) in nukleotida cikličnega gvanozin monofosfata (cgmp) na aktivnost enos in kodacijo signala Ca 2+. Modela sta skladna v tem, da v obeh primerih strižna napetost v endotelijski celici sproži produkcijo inozitol trifosfata (IP3), kar vodi do sproščanja Ca 2+ iz znotrajceličnih shramb in do kodacije podobnih signalov Ca 2+. V obeh modelih je odziv produkcije NO na strižno napetost dvofazen, pri čemer je za pojav druge faze bistvenega pomena signalna pot, ki vključuje encima fosfoinozitid 3-kinazo (PI3K) in Akt. Oba encima imata ključno vlogo pri fosforilaciji encima enos, ki je potrebna za dosego njegove največje aktivnosti. Čeprav noben izmed modelov ni povsem popoln, pa vsak izmed njiju omogoča poglobljen in sistematičen vpogled v razumevanje kompleksnih biokemijskih procesov, ki jih lahko sproži strižna napetost v karotidi, in hkratno kvantitativno ovrednotenje pomembnosti posameznih signalnih poti in procesov. ii

8

9 ABSTRACT In this master thesis systematic descriptions of known mechanisms of shear stress detection, their effect on the endothelium of the carotid and other arteries, as well as the role of known mechanisms on the production of nitric oxide (NO) are presented. The key mechanosensing complexes that respond to changes in shear stress and which trigger different signalling pathways in endothelial cells are: ion channels, tyrosine kinase receptors, G-protein coupled receptors (GPCR), kaveoles, adhesion proteins, cytoskeleton, glycocalyx and primary cilia. More attention was paid to the description of intercellular coupling, which has an increasing role in mechanotransduction of shear stress and activation of anti-atherosclerotic signalling pathways. Further, we present a mathematical model that includes ion channels, integrins and GPCR as mechanosensors. The model is evaluated in order to determine its ability to reproduce the relevant measured data on the NO production. That model is compared with another model that takes into account the influence of two mechanosensors (integrins and GPCR) but includes a more detailed description of the effects of calcium/calmodulin (Ca 2+ /CaM) complex, protein kinase B (Akt) and heat-shock protein (Hsp90) on the activity of the enzyme endothelial nitric oxide synthase (enos). The latter does not include the inhibitory effect of the enzyme protein kinase C (PKC) and the nucleotide cyclic guanosine monophosphate (cgmp) on the activity of enos and the encoding of Ca 2+ signal. In both models shear stress triggers the production of inositol tris-phosphate (IP3), leading to the release of Ca 2+ from intracellular stores and to the encoding of similar Ca 2+ signals. In both models, the NO production profile is biphasic, whereby the signalling pathway involving the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and the enzyme Akt are essential for the occurrence of the second phase. It is found out that these two enzymes play a key role in the phosphorylation of the enos enzyme needed to achieve its maximal activity. Although none of the models is complete, they provide an in-depth and systematic insight into the understanding of complex biochemical processes that are triggered by shear stress in carotid artery. And, moreover, they both allow quantitative evaluation of the significance of individual signalling pathways and processes. iii

10

11 POGOSTO UPORABLJENE OKRAJŠAVE AA AC Akt ATP Ca 2+ CaM CaM-K camp cgmp C-JNK Cl - DG EC ECM enos ERK FAK FN G-protein GMC GPCR GTP HDL ICAM-1 inos IP3 K + L-Arg LDL arahidonska kislina adenilat ciklaza protein kinaza B adenozin-5'-trifosfat kalcijev ion kalmodulin kalmodulin kinaza ciklični adenozin monofosfat ciklični gvanozin monofosfat c-jun N-terminalna kinaza klorov ion diacilglicerol endotelijska celica zunajcelični matriks endotelijska sintaza NO zunajcelično regulirana kinaza kinaza fokalnih adhezij fibronektin protein G gladka mišična celica receptorji, skopljeni z G-proteinom gvanozin trifosfat lipoprotein visoke gostote znotrajcelična adhezijska molekula-1 inducibilna sintaza NO inozitol trifosfat kalijev ion aminokislina arginin lipoprotein nizke gostote iv

12

13 MAPK z mitogenom aktivirana protein kinaza MHC težke verige miozina MLCK kinaza lahkih verig miozina MLCP fosfataza lahkih verig miozina MPSS srednje pozitivna strižna napetost Na + natrijev ion NFκB nuklearni faktor kapa B NO dušikov oksid PECAM-1 trombocitna endotelna celična adhezijska molekula-1 PG prostaglandin PI3K fosfoinozitol 3-kinaza PKA protein kinaza A PKC protein kinaza C PKG protein kinaza G PL fosfolipid PLA2 fosfolipaza A2 PLC fosfolipaza C R receptor SERCA Ca 2+ /ATP-aza sarkoplazemskega/endoplazemskega retikuluma SR sarkoplazemski retikulum sgc topna gvanilat ciklaza TK tirozin kinaza VEGFR2 receptor vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja 2 VE-kadherin vaskularno endotelijski kadherin v

14

15 KAZALO 1 UVOD IN OPIS PROBLEMA NAMEN IN CILJI NALOGE METODOLOGIJA IN HIPOTEZE HIPOTEZE VPLIV STRIŽNE NAPETOSTI NA ENDOTELIJ VPLIV MEHANSKIH FAKTORJEV NA ATEROSKLEROZO MEHANOTRANSDUKCIJA AKTIVACIJA SIGNALNIH POTI, KI VODIJO DO TRANSKRIPCIJE GENOV KANDIDATI ZA SENZORJE STRIŽNE NAPETOSTI Ionski kanali Kaveole komponente celične membrane Receptorji, sklopljeni z G-proteinom (GPCR) komponenta celične membrane Receptorji vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja (VEGFR) komponente celične membrane Glikokaliks zunajcelične komponente Primarne migetalke zunajcelične komponente Citoskelet zunajcelične komponente Adhezijski proteini Integrini Tesni medcelični stiki S STRIŽNO NAPETOSTJO INDUCIRANA SIGNALNA POT DUŠIKOVEGA OKSIDA V ENDOTELIJSKI CELICI MATEMATIČNI MODEL SIGNALNE POTI DUŠIKOVEGA OKSIDA V ENDOTELNI CELICI Aktivacija G-proteinov Kalcijeva signalizacija Aktivacija fosfoinozotid 3-kinaze (PI3K) Fosforilacija in formiranje različnih kompleksov enos...38 vi

16

17 7.1.5 Produkcija dušikovega oksida PRIMERJAVA REZULTATOV MODELA IN MERITEV NAPOVEDI MODELA NAPOVED VPLIVA INHIBICIJ RAZLIČNIH PROTEINSKIH KINAZ NA PRODUKCIJO NO NAPOVED VPLIVA KOMPLEKSA Ca 2+ /CaM NA AKTIVACIJO enos IN PRODUKCIJO NO PREGLED NEKATERIH PRIMERLJIVIH RAZISKAV ZAKLJUČEK IN OVREDNOTENJE HIPOTEZ LITERATURA...60 vii

18

19 SEZNAM SLIK Slika 1: Shematski prikaz laminarnega toka krvi skozi valjasto cev. τs je strižna napetost, izražena kot sila trenja na enoto površine, ki deluje na notranjo steno žile oziroma na površino endotelija kot posledica toka viskozne tekočine... 6 Slika 2: Prerez arterije... Napaka! Zaznamek ni definiran. Slika 3: Signalne poti, aktivirane s strižno napetostjo...13 Slika 4: Strižna napetost in z njo povezane signalne poti... Napaka! Zaznamek ni definiran. Slika 5: Senzorji strižnih sil Slika 6: Prenos signala strižne napetosti prek signalne poti Src Napaka! Zaznamek ni definiran. Slika 7: Model s strižnimi silami inducirane aktivacije JNK...23 Slika 8: Medcelični stiki in stiki celica-matriks... Napaka! Zaznamek ni definiran. Slika 9: Potencialni mehanizem sestave mehanosenzornega kompleksa...27 Slika 10. Signalna pot dušikovega oksida (NO)... Napaka! Zaznamek ni definiran. Slika 11: Signalna pot sklopitve strižne napetosti in produkcije NO...31 Slika 12: A) Normirana produkcija NO v stacionarnem stanju v odvisnosti od strižne napetosti in B) Normirana produkcija NO v odvisnosti od časa pri različnih vrednostih strižne napetosti...44 Slika 13: A) Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti koncentracije NO pri treh različnih vrednostih strižne napetosti. B) Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti dviga koncentracije NO nad bazalno vrednost pri treh različnih vrednostih strižne napetosti... Napaka! Zaznamek ni definiran. Slika 14: Časovna odvisnost različnih modelnih spremenljivk za tri različne strižne napetosti 8, 16 in 24 dynes/cm 2 (polna, prekinjena, črtkana črta)...46 Slika 15: Vpliv modulacije aktivnosti proteinskih kinaz na produkcijo NO...47 Slika 16: Časovna odvisnost koncentracije NO v EC... Napaka! Zaznamek ni definiran. viii

20

21 SEZNAM TABEL Tabela 1: Vrednosti modelnih parametrov...41 ix

22

23 viii

24

25 1 UVOD IN OPIS PROBLEMA Vaskularne endotelijske celice (EC) mejijo na luminalno površino krvnih žil in so izpostavljene silam cirkulacije, kot je strižna napetost, dilataciji žil in krvnemu tlaku. Te mehanske obremenitve dobro poznamo in igrajo ključno vlogo pri regulaciji funkcije EC in vaskularnega remodeliranja. Mehanske sile so pomembni modulatorji EC. Endotelij se hitro in občutljivo odziva na mehanske pogoje, ki jih ustvarja tok krvi (Rubanyi, et al., 1986). Med tokom krvi skozi žile so te pod vplivom sil, ki jih ustvarja tok. Napetost vzporedno z žilno steno je definirana kot strižna napetost. Ta predstavlja silo trenja, ki jo povzroči tok krvi na površini endotelija žilne stene. Endotelijske celice razlikujejo med komponentami toka in se različno odzivajo prek različnih mehanokemijskih transdukcijskih poti (Frangos, et al., 1996). Dejstvo pa je, da mehanizmi, s katerimi celice zaznavajo in se odzivajo na te sile, še niso popolnoma raziskani. Identifikacija in karakterizacija mehanoreceptorjev podpirata teorijo vpliva strižne napetosti na tonus žilnih sten. Poznani potencialni senzorji strižne napetosti so ionski kanali, receptorji tirozin kinaze, G-proteini, kaveole, citoskelet, glikokaliks in mehanosenzorni kompleks medceličnih stikov, ki je sestavljen iz PECAM-1, VE-kadherina in VEGFR2 (Ando, & Yamamoto, 2013). Mehanska stimulacija EC sproži kompleksno kaskado biokemičnih reakcij, ki vključuje več mehanosenzorjev. Predlaganih je več teorij (Nichols, & O'Rourke, 1990) o tem, kako EC zaznajo strižno napetost in posredujejo te informacije kot znotrajcelični kemični signal. Endotelijske celice ob izpostavljenosti mehanskim silam, kot je strižna napetost, proizvedejo dušikov oksid (NO) (Balligand, et al., 2009). NO igra v žilah ključno biološko vlogo, in sicer regulira tonus vaskularnih gladkih mišic ter posledično uravnava krvni tlak. Obstoječi matematični modeli, ki opisujejo produkcijo NO v EC, že vključujejo nekatere vplive do sedaj poznanih mehanosenzorjev, vendar je pot do celovitega modela še dolga. V magistrskem delu si prizadevamo obravnavati čim več obstoječih teorij in njihove relevantne podatke 1

26 smiselno urediti ter poiskati in opozoriti na potrebo po vključitvi dodatnih signalnih poti, ki bi morda lahko pripomogle k izboljšanju modelov. 2

27 2 NAMEN IN CILJI NALOGE Namen magistrskega dela je pregledati obstoječe relevantne podatke s področja mehanizmov zaznavanja strižne napetosti, jih urediti, analizirati rezultate za izbrane spremenljivke ter poiskati sistemske parametre, njihove velikosti in medsebojne kvalitativne in kvantitativne povezave. Glavni cilji magistrskega dela so: iz podatkovnih baz in literature poiskati podatke, ki karakterizirajo signalne poti mehanotransdukcije, ureditev podatkov z namenom ustvariti ustrezen pregled vpliva strižne napetosti toka krvi na endotelij karotide v obravnavanem kompleksnem sistemu v steni karotide skupaj s hemodinamiko toka krvi, definirati potencialne kandidate za mehanosenzorje strižne napetosti v EC, pregled obstoječih teoretičnih in matematičnih modelov in medsebojnih vplivov sistemskih spremenljivk na obravnavan hemodinamski in biokemijski sistem, kot so na primer koncentracije NO in Ca 2+, aktivacija signalnih poti v endoteliju in vpliv strižne napetosti na produkcijo NO, pregled ključnih spremenljivk, njihovih vrednosti in njihovih medsebojnih vplivov, pregled matematičnega modela, ki vključuje vplive poznanih mehanosenzorjev strižne napetosti na produkcijo NO. 2

28 3 METODOLOGIJA IN HIPOTEZE Raziskavo bomo začeli s pregledom relevantnih podatkov iz literature in podatkovnih baz, ureditvijo pridobljenih podatkov ter interpretacijo morebitnih ujemanj ali razhajanj. Pregledali bomo literaturo z različnih medsebojno povezanih področij (hemodinamika, biomehanika, biokemija). Pri delu bomo predvidoma uporabili dve metodi, in sicer zbiranje podatkov iz podatkovnih baz in matematično modeliranje. Matematični model je sistem povezanih enačb, ki opisujejo biološke in fiziološke sisteme v matematičnem jeziku. Bioinformatika je področje, ki omogoča obsežne raziskave bioloških procesov z računalniškimi orodji. Hkrati vključuje tudi zbiranje, analizo in uporabo poznanih bioloških podatkov prek računalnika v namene raziskovanja. Na področju genetike in molekularne biologije dnevno potekajo raziskave, katerih rezultate raziskovalci vnašajo v podatkovne baze. Z zbiranjem podatkov iz podatkovnih baz bomo z različnimi raziskovalnimi pristopi (kvantitativna raziskava, kvalitativna raziskava, teoretična raziskava) iz literature izluščili za nas relevantne mehanizme, ki bodo omogočali sestaviti kompleksno usklajeno sliko raziskovanih hemodinamskih in biokemijskih procesov. Osredotočili se bomo na raziskave medsebojnih vplivov hemodinamike toka krvi po karotidi ter biokemijskih in mehanskih procesov v steni karotide. 3.1 HIPOTEZE V magistrskem delu bomo preverili veljavnost naslednjih hipotez: 1. Podatki iz podatkovnih baz in literature nam omogočajo sestaviti kompleksno usklajeno sliko hemodinamskih in biokemijskih procesov skupaj z identifikacijo določenih sistemskih parametrov in kvantitativnim ovrednotenjem njihovih pomembnosti v delovanju obravnavanega kompleksnega sistema. 2. Eksperimentalni podatki iz literature praviloma dajejo ustrezne in primerljive rezultate ter podatke. 3

29 3. Raziskava omogoča celovitejši in poglobljen vpogled v nastanek in razvoj aterosklerotičnih leh. 4

30 4 VPLIV STRIŽNE NAPETOSTI NA ENDOTELIJ Strižna napetost toka krvi je tangencialna obremenitev endotelija v žilni steni in je določena s tokom krvi, geometrijo žile in viskoznostjo krvi. Računsko je ocenjena z modeli hemodinamike in je izražena v enotah tlaka, torej N/m 2 oz. Pa (Resnick, 2003). V tuji literaturi zasledimo tudi enoto dyn/cm 2 oz. dynes/cm 2, kar znaša 0,1 Pa. Vrsta toka je določena z Reynoldsovim številom (Re), ki je kriterij, s katerim se lahko napove, ali je tok laminaren ali turbolenten. Pri nižjih hitrostih tekočine viskozne sile prevladujejo nad vztrajnostnimi silami, tok sledi geometriji žil in je laminaren. Pri hitrostih tekočine, ko so viskozne sile in vztrajnostne sile med seboj primerljive, se na arterijskih zavojih in bifurkacijah pojavi prehod v turbulence. Pri tem so vrednosti Re med 500 in in so odvisne od žilne geometrije (Nichols-O'Rourke, 1990). Re je definiran kot: = ƞ, (1) kjer je R polmer cevi, ν hitrost tekočine, ƞ njen koeficient viskoznosti in ρ njena gostota. Luminalna površina krvne žile in površina endotelija sta nenehno izpostavljeni strižnim napetostim, ki so odvisne od hemodinamike. Velikost strižne napetosti lahko v večini krvnih žil ocenimo s Poiseuillovim zakonom. Poiseuillov zakon določa, da je strižna napetost (τ) sorazmerna z viskoznostjo tekočine (ƞ) in volumskim pretokom (ΦV) ter obratno sorazmerna s tretjo potenco notranjega polmera žile (R) (LaBarbera, 1990): τ = ƞ ³, (2) Različne meritve kažejo, da je strižna napetost krvi venskega sistema v območju od 1 do 6 dynes/cm 2, v arterijah pa med 10 in 70 dynes/cm 2. Številni eksperimenti so pokazali, da ima strižna napetost aktivni vpliv na preoblikovanje žilne stene (Kamiya, & Togawa, 1980; Langille, & O'Donnell, 1986). Vplive povečanja krvnega pretoka so opazovali tudi v arterijah dializnih bolnikov. Pri njih je bila strižna napetost višja, kar 5

31 je vodilo do ekspanzije luminalnega radija (Girerd, et al., 1996). Po drugi strani zmanjšana strižna napetost, ki izhaja iz nižjega toka ali manjše viskoznosti krvi, povzroči zmanjšanje notranjega polmera žile (Langille, & O Donnell, 1986). Slika 1: Shematski prikaz laminarnega toka krvi skozi valjasto cev. τ s je strižna napetost, izražena kot sila trenja na enoto površine, ki deluje na notranjo steno žile oziroma na površino endotelija kot posledica toka viskozne tekočine (Malek, 1999). Laminarni tok, kot ga prikazuje slika 1, predstavlja normalno stanje toka krvi v večini kardiovaskularnih sistemov. Laminarni tok si lahko predstavljamo kot veliko število vzporednih plasti tekočine, ki se gibljejo vzporedno s steno žile in imajo različne hitrosti. Takšen tok ima paraboličen profil, pri katerem se plast tik ob steni giba najpočasneje oz. ima teoretično hitrost 0, plasti v sredini imajo najvišje hitrosti, hitrost pa se spreminja kot kvadratna funkcija oddaljenosti od središča žile. Tok krvi po žili povzroči nastanek strižnih sil na steno žile torej na endotelij, kot prikazuje slika 2. 6

32 Slika 2: Prerez arterije. Prikaz endotelijskih celic, ki tvorijo notranjo plast in plast gladkih mišičnih celic. Strižna napetost deluje vzdolžno v smeri toka krvi (Hahn, 2009). Narava oz. vzrok strižne napetosti in njen obseg na dani lokaciji vaskularnega sistema igrata pomembno vlogo v dolgoročnem zdravstvenem stanju krvne žile. Krvne žile delimo na arterije, arteriole, kapilare, venule in vene. Kri v srce po venah priteka, po arterijah pa iz njega odteka. Arterije so debelejše in prožnejše kot vene, vendar imajo slednje večji premer. Arterije so izpostavljene večjim pritiskom kot vene, imajo debelejše stene in so prožnejše. Vene imajo večji luminalni premer, kri pa se po njih pretaka počasneje. Žilna stena je tako pri venah kot pri arterijah sestavljena iz treh plasti, ki jih delimo na notranjo plast ali intimo, srednjo plast ali medijo in zunanjo plast ali adventicijo (Slika 2). Karotidne arterije so najbolj izpostavljene nastanku aterosklerotičnih leh, ki pogosto nastajajo na razcepiščih žil, kjer prihaja do motenj pretoka krvi in posledično turbulenc. Čeprav nekatere zgodnje študije nakazujejo, da lahko nivoji visoke strižne napetosti vodijo do degeneracije endotelijske površine in erozije (Fry, 1968; Langille, 1984), je večina dokazov skladna s stališčem, da kronično izpostavljanje EC srednje visoki strižni napetosti spodbuja anti-aterosklerozni učinek (Davies, 1995; Traub, & Berk, 1998). Tako imenovana povprečna pozitivna strižna napetost (angl. mean positive shear stress MPSS) spodbuja sproščanje zaščitnih faktorjev iz EC, ki zavirajo koagulacijo oz. strjevanje krvi, migracijo levkocitov in proliferacijo gladkih mišic, ki 7

33 arterije obvarujejo pred pojavom ateroskleroze. MPSS je lahko tudi ključnega pomena za preživetje EC. Številni raziskovalci so dokazali, da je MPSS potrebna za optimalno regeneracijo poškodovanega endotelija (Levesque, et al., 1990; Vyalov, et al., 1996; Albuquerque, et al., 2000). Medtem ko je MPSS potrebna za integriteto endotelijskih celic, se zdi tudi, da inhibira endotelijsko proliferacijo. Morfologija endotelijskih celic v regijah venskega povratnega toka je tudi bistveno drugačna od celic, ki se nahajajo v regijah MPSS (Flaherty, et al., 1972; Dewey, et al., 1981). Celice v regijah z nižjimi strižnimi napetostmi niso poravnane in so značilne zaobljene oblike, imajo povečano proliferacijo in večjo prepustnost kot na mestih, kjer je prisotna MPSS (Langille, & Adamson, 1981; Levesque, et al., 1986; Okano, & Yoshida, 1993). 8

34 5 VPLIV MEHANSKIH FAKTORJEV NA ATEROSKLEROZO Mehanske sile z več vidikov uravnavajo fiziologijo žil in njihovo funkcijo ter imajo ključno vlogo pri mehanizmih homeostaze in arterijskih boleznih. Znatno povečanje strižne napetosti v krajšem času sproži nastajanje NO in prostaciklina, ki spodbujata vazodilatacijo. Po drugi strani pa dolgoročne spremembe v toku lahko vodijo do strukturnih prilagoditev homeostaze, ki omogoča, da se fiziološki procesi kljub večjim spremembam v okolici ne spreminjajo bistveno. Proces preoblikovanja arterij, vključno z angiogenezo (rast novih krvnih žil iz obstoječih) in arterogenezo (povečanje premera obstoječe arterije), je zelo občutljiv na lokalne mehanske pogoje (Hoefer, et al., 2013). Dodatno povečan tok vodi do povečanja premera arterij, kar spodbuja perfuzijo tkiva (Hudlicka, et al., 2006). Ateroskleroza prizadene notranjo plast arterijske stene, ki se zadebeli in postane manj prožna. Za aterosklerozo je značilno kopičenje maščobe pod notranjo plastjo arterijske stene (intima), kar povzroči zoženje žilne svetline ali celo njeno zamašitev, saj nastala aterosklerotična leha postopoma raste. Je vnetno stanje žile, ki nastane kot posledica kopičenja lipoproteinov nizke gostote (LDL) in hemodinamskega stresa. Povišan LDL je glavni dejavnik pri razvoju bolezni, saj se infiltrira in kopiči na notranji strani arterij. To vodi do aktivacije EC in posledično do prehoda levkocitov (natančneje makrofagov) v subendotelijski prostor. Leha se tvori, ker makrofagi znotraj arterije sprožijo vnetni odgovor in posledično poškodbo tkiva. Na aterosklerozo vplivajo tudi številni genetski faktorji kot tudi faktorji iz okolja. Čeprav je ateroskleroza povezana s sistemskimi dejavniki tveganja (npr. spol, starost in visok holesterol), se plaki oblikujejo prednostno v razcepiščih arterij, ki so izpostavljene neenakomernemu toku krvi (Malek, 1999). Tudi o nastanku aterosklerotičnih plakov obstaja več teorij. Košnik, et al. (2011) opisujejo hipotezo o vplivu poškodovanega endotelija na nastanek ateroskleroze. V svojem delu kot glavne vplivne faktorje na endotelij navajajo fizikalne faktorje (turbulenca krvi, visok tlak), kemične faktorje (nikotin, ogljikov monoksid), presnovne faktorje (holesterol) in biološke faktorje (bakterije, virusi, trombociti, levkociti). Vnetje arterijske stene je najpomembnejši poznan vzrok 9

35 ateroskleroze. Strižna napetost regulira nastajanje aterosklerotičnih plakov. Vnetja in formacije lezij v arterijah so povezane z velikostjo in vzorcem strižne napetosti. Do sedaj sta bila prepoznana dva mehanizma, ki lahko pojasnita povezavo med motnjami obtoka in razvojem ateroskleroze. Teorija masnega transporta pravi, da je prenos nekaterih bioaktivnih snovi, kot je LDL iz obtoka do žilne stene, povečan na mestih motenega toka, in sicer zaradi povečanega stika med krvjo in EC. To se razlikuje od teorije strižne napetosti, ki poudarja učinke krvnega obtoka, ki ga inducirajo mehanske sile, na vaskularno fiziologijo. Predlagani teoriji si nasprotujeta, vendar se ne izključujeta. Tako masni transport kot oblikovanje plakov pod vplivom strižne napetosti na funkcionalni ravni delujeta vzajemno. Strižna napetost namreč vpliva na prepustnost žil, kar pa regulira molekularni transport (Back, et al., 1999). 10

36 6 MEHANOTRANSDUKCIJA Mehanotransdukcija je proces, pri katerem celice zaznajo in se odzovejo na mehanske signale ter jih pretvorijo v biokemijski signal. Mehanotransdukcija igra pomembno vlogo tako pri normalnih fizioloških stanjih kot tudi pri boleznih, kot so rak, ateroskleroza in visok krvni tlak. Ko celice izpostavimo mehanskim silam, se aktivirajo številne signalne poti. Prav v vaskularnem sistemu je to najbolj očitno, saj strižna napetost zaradi toka krvi igra ključno vlogo pri oblikovanju krvnih žil in določanju njihovih funkcij in disfunkcij. Mehanske sile, ki jih povzroči tok krvi, imajo močne regulatorne vplive na fiziologijo in patologijo kardiovaskularnega sistema. Ena izmed najpomembnejših je strižna napetost, ki deluje na endotelij in celotno steno ožilja (Davies, 2009). Vzroki in posledice tega delovanja v veliki meri vzbujajo veliko interesa prav zaradi dejstva, ker se ateroskleroza pojavlja selektivno na ukrivljenih ali razvejanih arterijskih regijah, ki so izpostavljene krajšim obdobjem strižnih napetosti oz. preobratom strižne napetosti (Davies, 2008). Ti podatki kažejo na obstoj sinergij med mehanskimi silami in drugimi dejavnikih pri nastanku lezij. Sile zaradi toka krvi so prav tako bistvenega pomena za pravilni embrionalni razvoj srca in ožilja (Hove, et al., 2003). Dejstvo, da se EC odzovejo na strižno napetost s spremembo svoje morfologije, funkcije in genske ekspresije, indicira, da EC zaznajo strižno napetost kot signal, ki ga posredujejo v notranjost celice. Veliko število študij, omenjenih v našem delu, opisuje mehanotransdukcijo strižne napetosti, kljub temu pa ostaja še veliko nerazjasnjenega. V naslednjih poglavjih bomo obravnavali signalne poti, ki naj bi jih aktivirala strižna napetost, in poznane kandidate za senzorje strižne napetosti. 6.1 AKTIVACIJA SIGNALNIH POTI, KI VODIJO DO TRANSKRIPCIJE GENOV V transdukcijo signala strižne napetosti je vključenih veliko signalnih poti, kot prikazuje Slika 3. Ob aktivaciji ionskih kanalov številni ioni, vključno s Ca 2+, K +, Cl - in Na +, vstopajo ali izstopajo iz celice in mehanski signali se prevedejo v spremembe v membranskem potencialu ter v spremembo znotrajcelične koncentracije ionov. 11

37 Strižna napetost med drugim aktivira receptorje, povezane z G-proteini (GPCR), in posledično se poveča aktivnost encimov adenilat ciklaza (AC) in fosfolipaza C (PLC). To sproži produkcijo sekundarnih prenašalcev, vključno s camp, Ca 2+, IP3 in diacilglicerolom (DG). camp nato aktivira od camp odvisno protein kinazo (PKA), ki katalizira fosforilacijo številnih proteinov. Ob povišanju koncentracije citostolnega Ca 2+ se ta veže na protein kalmodulin (CaM), s čimer se aktivirajo od CaM odvisne kinaze (CaM-K, MLCK, enos in druge). IP3 se veže na receptorje za IP3 (IP3-R) na kanalih v endoplazemskem retikulumu (ER), kjer je shranjen Ca 2+. To poviša njihovo prepustnost za Ca 2+. Receptorji tipa tirozin kinaza (TK) prenesejo signal prek fosfoinozitol-3-kinaze (PI3K) in fosforilacije majhnih proteinov GTP-az iz družine Ras, kar vodi v aktivacijo MAP-kinaze (MEK). Po drugi strani lahko signali strižne napetosti vstopajo prek adhezijskih molekul, kot so npr. integrini. Aktivacije vseh teh signalnih poti vodijo do aktivacije transkripcijskih faktorjev (CREB/ATP in Jun&Fos) in s tem do sprememb v funkciji EC (Ando, & Yamamoto, 2013). 12

38 Slika 3: Signalne poti aktivirane s strižno napetostjo. V signalno transdukcijo strižne napetosti so vključene mnoge signalne poti, kar vodi do spremembe morfologije in funkcije EC ter aktivacije številnih transkripcijskih faktorjev. Sicer ni jasno, katere poti so primarne, obstaja pa možnost, da strižna napetost aktivira več signalnih poti hkrati. Oznake na sliki: R (receptor), G (protein), AC (adenilat ciklaza), camp (ciklični adenozin 3'-, 5'-monofosfat), ATP (adenozin 5'-trifosfat), TK (tirozin kinaza), PL (fosfolipid), PLA 2 (fosfolipaza A 2), AA (arahidonska kislina), PG (prostaglandin), PLC (fosfolipaza C), IP 3 (inozitol trifosfat), DG (1,2-diacilglicerol), PKA (protein kinaza A), CaM-K (kalmodulin kinaza), PKC (protein kinaza C), PI3-K (fosfoinozitol 3-kinaza), Ras in Raf (družina majhnih GTP-az), MEK (MAP kinaza-erk kinaza), MEKK (MAP-kinaza ERK-kinaza), JNK (c-jun N-terminalna kinaza), p38 MAPK (z mitogenom aktivirana kinaza), Sos in Grb2 adapterski proteini, FAK (kinaza fokalnih adhezij), O 2 - in H 2O 2 reaktivne kisikove spojine, CREB/ATP (c-amp vezavni protein/aktivacijski transkripcijski faktor), NFκB (nuklearni faktor kapa B), Jun&Fos družina (AP-1) transkripcijskih faktorjev (AP-1) Ando&Yamamoto (2013). Strižna napetost v EC aktivira številne signalne poti, ki so prikazane na Sliki 4, nekaj smo jih že opisali in prikazali na Sliki 3, obstajajo pa še druge pomembne tarče, kot so: kinaza fokalnih adhezij (FAK) (Berk, et al., 1995), Rho družina GTPaz (Li, et al., 1999), PI3K (Go, et al., 1998) z mitogenom aktivirana protein kinaza (MAPK) (Tseng, et al., 1995), protein kinaza C (PKC) (Tseng, et al., 1995) in nuklearni faktor-κb (NFκB) (Lan, et al., 1994). Strižna napetost prek integrinov povzroči povečanje FAK, kar vodi do aktivacije signalne poti Ras/MAPK. FAK je vključen tudi v aktivacijo Cdc42 in RhoA, ki sta člana Rho družine GTPaz. Glavni odziv družine GTPaz v EC na strižno napetost je aktivacija JNK/aktivatorskega proteina (AP-1), nuklearnega faktorja kapa B (NK-κB) in c-fos (Tzima, et al., 2008). 13

39 Slika 4: Strižna napetost in z njo povezane signalne poti. Strižno napetost zaznavajo številni mehanotransduktorji, ki se nahajajo na membrani EC. Ti sprožijo več signalnih poti, ki vplivajo na gensko ekspresijo in funkcijo endotelija ter potekajo prek aktivacije naslednjih proteinov oz. encimov: MAPK (z mitogenom aktivirana proteinska kinaza), ERK (zunajcelično regulirana kinaza), C-JNK (c- Jun N-terminalna kinaza), PI3-K (fosfoinozitol 3-kinaza), Akt (protein kinaza B), FAK (kinaza fokalnih adhezij), Rho družine GTP-az (majhni proteini G), NF-κB (nuklearni faktor kapa B), PKC (protein kinaza C) (Johnson, 2011). Omenili smo že, da strižna napetost v EC aktivira encim PI3K, pri čemer se sprosti in aktivira protein kinaza B (Akt), ki ima aktivno vlogo pri celični proliferaciji (Rossig, et al., 2001) in fosforilaciji enos. Slednja vodi v produkcijo NO. Sledi, da ima s strižno napetostjo inducirana signalna pot PI3K/Akt enega od ključnih vplivov na produkcijo NO. MAPK je družina serinskih in treoninskih (Ser/Thr) kinaz, ki vključuje p38, ERK in JNK. p38 je vključen v signalizacijo MAP in je, podobno kot ERK in JNK, aktiviran s strižno napetostjo. Aktivacija signalne poti p38 sproži produkcijo protivnetnih citokinov in je vključena v proces celične apoptoze. JNK, ki je aktiviran prek signalne poti PI3K, ima prav tako aktivno vlogo pri celični apoptozi. Aktivacija encima ERK, ki je odvisna od drugih kinaz in signala Ca 2+, ima aktivno vlogo pri rasti celic. Strižna napetost vpliva tudi na signalno pot PKC. Aktivacija PKC aktivira ERK (Trau, et al., 1997) in ima pomembno vlogo pri genski ekspresiji endotelina-1 (Morita, et al., 14

40 1994.). Na splošno strižna napetost vpliva na približno genov endotelijske celice, ki vplivajo na rastne faktorje, vazoaktivne substance, endogene antioksidante, koagulacijske faktorje in kemoatraktante. Če povzamemo, se vpliv strižne napetosti na induciranje genske ekspresije EC odraža kot anti-aterosklerotično okolje. 6.2 KANDIDATI ZA SENZORJE STRIŽNE NAPETOSTI Čeprav strižna napetost aktivira številne signalne transdukcijske poti, je še vedno precej nejasno, katere so primarne. Kljub pregledu številne literature ugotavljamo, da še vedno niso natančno opredeljeni primarni mehanizmi in senzorji, ki zaznavajo strižno napetost. Hemodinamske sile vključno s strižno napetostjo vplivajo na endotelne celice in njihove funkcije. Predlaganih je več teorij (Nichols, & O'Rourke, 1990) o tem, kako EC zaznajo strižno napetost in posredujejo te informacije kot znotrajcelični kemični signal. Kot ključni faktorji pri mehanizmu zaznavanja strižne napetosti so se zaenkrat izkazali ionski kanali (Barakat, 1999), receptorji tirozin kinaze, receptorji, povezani z G-proteini (GPCR) (Gudi, et al., 2003), kaveole (Yu, et al., 2006), adhezijski proteini, citoskelet (Osborne, et al., 2006), glikokaliks (Paharis, et al., 2007), primarne migetalke (Hierck, et al., 2008) ter medcelični stiki (Tzima, et al., 2005) in filamenti (Helmke, et al., 2000). 15

41 Slika 5: Senzorji strižnih sil. (Aranda-Espinoza, 2014) Ionski kanali Različni ionski kanali so se izkazali kot kandidati za senzorje strižne napetosti. Kalijevi (K + ) kanali se odprejo kot odziv na strižno napetost, tok K + sproži transmembransko hiperpolarizacijo, medtem ko aktivacija kanalov za klor (Cl ) s strižno napetostjo inducira membransko depolarizacijo (Guetam, et al., 2006). Prehod Ca 2+ iz zunajceličnega medija prek celične membrane v citosol sproži od strižne napetosti odvisna aktivacija dveh ionskih kanalov, purinoreceptorjev P2X in kanalov TRP (angl. Transient Receptor Potential Channels). Oba tipa kanalov prepuščata Ca 2+ in se odpreta ob povišanju strižne napetosti. Pritok Ca 2+ v citosol sproži različne od Ca 2+ odvisne signalne poti, ki vodijo do odziva EC na strižno napetost in med drugim tudi do produkcije NO. Ta modulira vaskularni tonus in regulira vaskularno remodeliranje (Kohler, et al., 2006). Trenutno obstajajo tri teorije o tem, kako se ti kanali aktivirajo ob odzivu na strižno napetost. Prva teorija predpostavlja, da se ionski kanali aktivirajo zaradi fizične interakcije s krvnim tokom. Odprtje ionskega kanala naj bi povzročila sila upora, ki nastane kot posledica toka krvi. Kljub razširjenosti te teorije pa obstaja vsaj ena raziskava (Barakat, et al., 2006), ki te predpostavke zavrača. S pomočjo 16

42 matematičnega modeliranja so namreč pokazali, da je za odprtje kanala potrebna veliko večja energija, kot jo generira tok krvi. Druga teorija o tem, kako ionski kanali zaznajo strižno napetost, temelji na interakciji ionskega kanala s citoskeletom, ki je, kot kaže, bistven za s strižno napetostjo inducirano proizvodnjo NO (Knudsen, & Frangos, 1997). Ko strižna napetost spreminja mehanske napetosti v citoskeletu, se ionski kanal, ki je povezan s citoskeletom, aktivira in omogoča tok ionov skozi celično membrano (Olesen, et al., 1988). Rezultati matematičnega modeliranja namreč kažejo, da lahko tok deformira senzorje in citoskeletne elemente, kar sproži s strižno napetostjo inducirane znotrajcelične signalne kaskade (Barakat, 2001). Pomanjkljivost te teorije je, da vzorci toka krvi, s katerimi so obravnavali ta mehanizem, niso bili primerljivi s tokom skozi arterijski krvni obtok. In vivo so EC izpostavljene tako strižni napetosti kot obodni napetosti, kar otežuje sposobnost za dešifriranje vplivov deformacije citoskeleta na prevodnost ionskih kanalov. Čeprav mehanizmi, na katerih temeljijo te interakcije, še niso dobro raziskani, je potencialna upravičenost te teorije podprta z opazovanji, da s strižno napetostjo povzročena deformacija citoskeleta lahko aktivira enos in poveča proizvodnjo NO (Cooke, et al., 1991). Tretja prevladujoča teorija, kako ionski kanali zaznajo strižno napetost, temelji na spremembah v fluidnosti membrane. Tok krvi ob površini celice spremeni viskoznost lipidnega dvosloja (Butler, et al., 2001). Obstaja raziskava (Lungu, et al., 2004), ki to teorijo tudi podpira. Ugotovili so namreč, da se zaradi izčrpavanja holesterola iz celične membrane zmanjša njena fluidnost. To vodi do aktivacije ERK in zmanjšanja odziva enos na strižno napetost (Lungu, et al., 2004). Iz obstoječih znanih teorij lahko zaključimo, da je do sedaj najbolj podkovana z dokazi tista teorija, ki vključuje vlogo citoskeleta in fluidnost membrane. Kljub temu pa so fizikalno-kemijski mehanizmi, ki definirajo transdukcijo strižne napetosti v EC, in zunajcelični odzivi na strižno napetost še precej nedefinirani. 17

43 6.2.2 Kaveole komponente celične membrane Kaveole nastanejo iz lipidnih raftov. Lipidni rafti so sestavljeni iz proteinov in lipidov, ki se nahajajo v celični membrani. Kaveolini so membranski proteini, ki vežejo holesterol. Zgradba kaveol je odvisna od holesterola. Če tega odstranimo, kaveole izginejo. Kaveole sodelujejo pri endocitozi, krčenju mišic in transdukciji signalov. Plazemska membrana endotelijskih celic vsebuje kaveole, kjer so lokalizirani številni ionski kanali, ki so udeleženi v signalizaciji Ca 2+ in sintezi ATP (Isshiki, et al., 2002). Vloga kaveole pri zaznavanju strižne napetosti je, da naj bi se znotrajcelični signal Ca 2+ začel v kaveoli in se šele nato kot val Ca 2+ razširjal skozi celotno celico (Isshiki, et al., 1998) Receptorji, sklopljeni z G-proteinom (GPCR) komponenta celične membrane GPCR so transmembranski receptorji, ki so vpleteni v mehanotransdukcijo strižne napetosti. V notranjost celice prenašajo zunajcelični signal in v njej sprožijo različne odzive. Strižna napetost ustvari konformacijsko spremembo na receptorju za bradikinin B2 in ga aktivira (Chachisvilis, et al., 2006). Ta konformacijska sprememba je predvidoma posledica spremembe fluidnosti membrane zaradi strižne napetosti Receptorji vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja (VEGFR) komponente celične membrane Strižna napetost lahko aktivira VEGFR (npr. VEFGR2 ali Tie-2), tako da poteče njihova fosforilacija s tirozin kinazo (TK) (Chen, et al., 1999). Strižna napetost naj bi inducirala gibanje dveh monomerov v receptorju, kar naj bi privedlo do njune interakcije in s tem do dimerizacije, ki se zgodi tudi ob vezavi liganda na receptor. Dimerizacija sproži proces fosforilacije receptorja tirozin kinaza in s tem sprožitve različnih signalnih poti, kot so: ERK, JNK, PI3K in Akt. Druga teorija pravi, da naj bi s tirozin kinazo pogojeno fosforilacijo sprožilo sproščanje ATP iz kaveol. Aktivacija signalne poti PI3K/Akt vodi v fosforilacijo enos in posledično v povišano produkcijo NO (Dimmeler, et al., 1999). 18

44 6.2.5 Glikokaliks zunajcelične komponente Glikokaliks je možen senzor strižne napetosti, saj je neposredno izpostavljen toku krvi (Weinbaum, et al., 2003). Glikokaliks je mreža glikoliziranih transmembranskih proteinov, ki štrlijo iz membrane EC v arterijski lumen in so pri pogojih nizke strižne napetosti v zvitem stanju. Z večanjem strižne napetosti se glikokaliks odvija v smeri toka, pri čemer se zgodi sprememba v njegovi konformaciji (Tarbell, & Ebong, 2008). Debelina glikokaliksa na površini EC je v razponu od 0,05 do 1,0 µm in je odvisna od premera žil (Secomb, et al., 2001). Glikokaliks se predvideva kot možni senzor strižne napetosti, saj ta neposredno občuti tok krvi (Weinbaum, et al., 2003). Njegova vloga pri odzivu EC na strižno napetost je bila dokazana v pasjih femoralnih arterijah (Mochizuki, et al., 2003). Večja kot je s tokom inducirana produkcija NO, manjša je degradacija hialuronske kisline (vrste glikozaminoglikanov) s hialuronidazo znotraj glikokaliksa. Predlagana sta bila dva mehanizma, ki razlagata, kako glikokaliks EC usmerja mehanotransdukcijo strižne napetosti. Prva teorija pravi, da je možen mehanizem, kjer je pod pogoji brez toka proteoglikan heparin sulfat prisoten v naključnem klopčiču, s povečanjem toka pa se ta klobčič prične razvijati v filamentno strukturo, kot prikazuje Slika 5G (Aranda-Espinoza, 2014). Druga domnevna vloga glikokaliksa v mehanotransdukciji strižne napetosti je prenos strižne napetosti skozi jedro proteina, na katerem je vezan glikokaliks. V tem primeru poteče fosforilacija enos, ki je rezultat aktivacije signalne poti Src (Slika 6) (Harrison, et al., 2006). Src prenese signale strižne napetosti, kar sproži fosforilacijo v signalni poti MAPK. Aktivira se transkripcijski faktor NFкB, ki sproži transkripcijo enos. 19

45 Slika 6: Prenos signala strižne napetosti preko signalne poti Src: Src prenese signale, ki regulirajo aktivnost sinteze enos. Prenos strižne napetosti preko Src sproži fosforilacijo signalne poti MAPK, ki vključuje Ras, Raf/MEK (MEK=MAPK in ERK) in ERK1/2. To vodi do aktivacije transkripcijskega faktorja NFκB in začetka transkripcije enos (Yung et al., 2005) Primarne migetalke zunajcelične komponente Novejše študije navajajo dokaze, da primarne migetalke nadzorujejo oz. so vključene v mehanizem, s katerim EC zaznajo in se odzovejo na strižno napetost (Hierck, et al. 2008). Primarne migetalke so fizično povezane z mikrotubulami citoskeleta. Predvideva se, da njihovo upogibanje pod vplivom toka prenaša signale strižne napetosti, in sicer prek citoskeleta v celice. Vezava primarnih migetalk lahko aktivira tudi ionske kanale za Ca 2+ in sproži signalizacijo Ca 2+ (Hierck, et al., 2008). Policistin-1 (11-kDa transmembranski protein z dolgo zunajcelično domeno) in policistin-2 (član super družine kanalov Trp) sta lokalizirana na migetalkah EC (Slika 5H). Znano je, da sta vključena v zaznavanje strižne napetosti. Njuna vloga je bila dokazana tako v človeških kot tudi v mišjih EC. Njuna mehanotransdukcija strižne napetosti aktivira od Ca 2+ odvisne signalne poti (Nauli, et al., 2003). EC brez izraženega policistina-1 in policistina-2 ne morejo prevesti signala strižne napetosti v spremembe v znotrajcelični koncentraciji Ca 2+ oz. v spremembe produkcije NO. 20

46 Zdi se, da migetalke ob povišani strižni napetosti razpadejo (Iomini, et al., 2004). Dodatno smo pregledali tudi raziskavo (Van Der Heiden, et al., 2008), ki navaja, da so migetalke in vivo locirane na predelih, ki so nagnjeni k razvoju ateroskleroze, kar indicira njihovo možno povezavo z odzivom na nizke strižne napetosti Citoskelet zunajcelične komponente Žive celice stabilizirajo svojo strukturo in obliko s pomočjo prepletene povezave citoskeletnih komponent, ki vključujejo mikrofilamente, mikrotubule in vmesne filamente. Predlagan je bil model, ki razlaga, kako se mehanske sile prevedejo v biokemijski odziv (Slika 5F) (Wang, et al., 2001). Ko so v modelu aplicirali mehanske sile, so se strukturni elementi premestili brez kakršnekoli topografske spremembe ali izgube tenzijske kontinuitete, ki bi lahko neposredno aktivirala signalne molekule, ki so povezane citoskeletom. Citoskelet se je izkazal za zelo pomemben faktor pri s strižno napetostjo inducirani produkciji NO in pri genski ekspresiji ICAM-1 (Imberti, et al., 2000) Adhezijski proteini Strižna napetost je iz apikalne površine EC posredovana skozi citoskelet do točk, kjer so medcelični stiki ter stiki med celicami in celičnim matriksom. To nakazuje, da so adhezijski proteini vključeni v mehanotransdukcijo strižne napetosti. Številne celične adhezijske molekule so bile povezane z zaznavanjem strižne napetosti. Strižna napetost aktivira integrine, kar vodi do aktivacije signalne transdukcijske poti Ras/ERK (Li, et al., 1997). V medceličnih stikih so locirane adhezijske molekule (PECAM-1) Integrini Integrini so transmembranski glikoproteini. Sestavljeni so iz α in β podenot (Slika 5E). Njihova zunajcelična domena vzajemno deluje z veliko proteini, ki se agregirajo na fokalnih stikih, vključno s signalnimi molekulami, kot so FAK in družina Src protein kinaz, ter citoskeletnimi proteini, kot so α-aktinin, vinkulin, talin, tenzin in paksilin (Rouoslahti, 1991). Obstajajo navedbe (Ishida, et al., 1996), da strižna napetost 21

47 aktivira integrine. Ko so ti aktivirani s strižno napetostjo, so zelo hitro aktivirani tudi FAK, paksilin, c-src, Fyn in p130 CAS, kar vodi do aktivacije signalne poti Ras/ERK. Strižna napetost prav tako povzroči, da se integrini translocirajo do kaveol, kar vodi do aktivacije kaveolina-1, Src in encima kinaze lahkih verig miozina MLCK (Shyy, & Chien, 2001). Strižna napetost povzroči tudi interakcijo integrinov z VEGFR2 (Wang, et al., 2002). Odzivi na tok so deloma posredovani s pomočjo kompleksa proteinov, ki ga sestavljajo PECAM-1 (trombocitna endotelno celična adhezijska molekula-1), VEkadherin (vaskularni endotelijski kadherin) in VEGFR2 (receptor vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja tipa 2), na stikih med endotelnimi celicami. Pomembnost tega kompleksa je razvidna že iz dejstva, da so variante genov, ki kodirajo PECAM-1, povezane z zgodnjim pojavom ateroskleroze in povečanim tveganjem za bolezni srca in ožilja, medtem ko izgubi VE-kadherina ali VEGFR2 pomenita embrionalno smrt zaradi vaskularnih endotelijskih nepravilnosti. Trombocitna endotelno celična adhezijska molekula-1 (PECAM-1), član superdružine imunoglobulinov, je lokalizirana na medceličnih stikih EC, kjer uravnava koncentracijo levkocitov med vnetnim odzivom. Predlagana je bila nova signalna pot (Fujiwara, 2006), kjer tirozin fosforilira PECAM-1 v 30 s od začetka izpostavljenosti strižni napetosti. Pri tem se aktivira signalna pot Ras, kar vodi do aktivacije ERK. Ti rezultati nakazujejo, da je PECAM-1 mehanosenzitivna molekula. Kadherini so veliki proteini adherentnih stikov, ki uravnavajo adhezije celica-celica. Predlagano je, da VE-kadherin, ki je specifičen za EC, formira mehanosenzorski kompleks s PECAM-1 in VEGFR2, ki igra ključno vlogo v signalni transdukciji strižne napetosti (Tzima, et al., 2005). Znotraj tega kompleksa kadherin deluje kot adaptor za tvorbo signalnih kompleksov. Predvideva se, da znotraj tega sistema PECAM-1 neposredno prevaja mehansko silo v aktivacijo VEGFR2, ki posledično aktivira encim PI3K. Ta posreduje pri aktivaciji integrinov, ima pa tudi ključno vlogo pri formaciji signalnega kompleksa (Slika 7). EC, ki niso imele izraženih VE-kadherina ali PECAM-1, so pokazale nenormalni odziv na strižno napetost. To pomeni, da ni bilo aktivacije signalnih poti PI3K/Akt in integrinov niti ni prišlo do poravnave aktinskih vlaken v smeri toka (Dejana, et al., 1999). 22

48 Integrini so transmembranski receptorski proteini, ki služijo povezavam med celicami ter med celicami in zunajceličnim matriksom (ECM). Dokazano je, da aktivacija zgoraj omenjenega mehanosenzornega kompleksa iz PECAM-1, VE-kadherina in VEGFR-2 zaradi strižnih sil sproži aktivacijo PI3K, ki nato aktivira integrine. Ko so ti aktivirani, se povežejo z ECM in sprožijo nadaljnjo signalizacijo. Endotelna celica je v normalnih pogojih povezana prek integrinov z bazalno membrano (večinoma iz laminina in kolagena IV). Bazalna membrana je tanka plast medceličnine, ki meji na vezivo od epitelijskih, endoteljskih, mišičnih ali perifernih celic. Na aterogenih mestih prihaja zaradi še nepojasnjenih mehanizmov do povečanega odlaganja fibronektina (FN). FN je glikoprotein, ki se nahaja v vezivnem tkivu na površju celic, tako v plazmi kot tudi v ostalih telesnih tekočinah. Aktivacija integrinov, ki jo sprožijo strižne sile v primeru prisotnosti FN, povzroči vezavo integrinov tudi na FN, kar sproži drugačen proinflamatoren odgovor endotelne celice prek aktivacije NF-κβ, PAK, MAPKKK in JNK. Posledičen nastanek proinflamatornih citokinov pospešuje migracijo ter aktivacijo levkocitov in pojav ateroskleroze (Slika 7). 23

49 Slika 7: Model s strižnimi silami inducirane aktivacije JNK. Strižne sile stimulirajo mehanosenzorni kompleks iz PECAM-1, VE-kadherina in VEGFR-2, kar aktivira PI3K. PI3K sproži aktivacijo nizkoafinitetnih integrinov, ki se nato vežejo na ECM in sprožijo raznolike signale. Pri celicah na FN se aktivira PAK, kar vodi do aktivacije JNK, ki inducira ekspresijo inflamatornih genov. Pri celicah na bazalni membrani se PAK ne aktivira zato se izrazi zaščitni profil genov (Hahn, 2009). Skupna sila strižne napetosti je zelo nizka v primerjavi z vlečnimi silami ali s silami žilno stenskega raztezanja. V večini primerov so odzivi na strižno napetost endotelno specifični (Orr, et al., 2006). Razlog je v tem, da se različni proteini v endoteliju različno odzovejo na strižno napetost. Kompleksi proteinov na medceličnih stikih so trenutno najbolje raziskani in jih bomo tudi mi podrobneje opisali Tesni medcelični stiki Celična adhezija in medcelični stiki so predpogoj za ustrezen metabolizem, sintezo proteinov in preživetje celic. Pomembnejši transmembranski receptorji, ki so odgovorni za celično adhezijo matriksa, so integrini, kadherini pa so pomembni za medcelične stike. Na zunajcelični matriks so adherentne celice»zasidrane«prek fokalnih adhezij (FAs), medtem ko so medcelični stiki vzpostavljeni prek fokalnih adherentnih strišč (FAJs). 24

50 Slika 8: Medcelični stiki in stiki celica-matriks (Alonso&Goldmann, 2016). Prenos sile in napetosti na teh adhezijskih mestih so razlog, da so medcelični stiki primerni kandidati za mehanosenzorje. Kateri proteini znotraj FAs oz. FAJs in katere membranske komponente zaznajo, prenesejo in se odzovejo na mehanokemijske signale, je trenutno tema raziskav, v katerih proučujemo mnoge kandidate. Kot že opisano, je mehanosenzorni kompleks medceličnih stikov sestavljen iz PECAM-1, VE-kadherina in VEGFR2 (Slika 9). Sproži mnoge s strižnimi silami posredovane celične odgovore, med drugim tudi celično poravnavo in anti-aterosklerotične signalne poti (Tzima, et al., 2005). PECAM-1 PECAM-1 je transmembranski protein iz družine imunoglobulinov (Ig), ki se večinoma nahaja v medceličnih stikih. Na citosolnem delu ima tirozin kinazne domene, ki se ob aktivaciji fosforilirajo. Fosforilacijo lahko sprožijo mehanski stimuli, kot so: raztegovanje celic na elastični podlagi, nabrekanje celic v hipoosmolarnem mediju in neposreden razteg molekule. Aktivacija PECAM-1 naj bi aktivirala signalno pot Erk, posredno aktivirala VEGFR2 in sprožila produkcijo NO. Polimorfizem enega nukleotida (SNP) gena za PECAM-1 pri ljudeh povzroči zgodnji razvoj ateroskleroze in povečano tveganje za srčno-žilne bolezni (Harry, et al., 2008). Vsekakor pa so in vivo rezultati zelo kompleksni. Narejena je bila študija (Goe, et al., 2008), kjer so primerjali vpliv PECAM-1 na aterosklerotične lezije pri miših. Ugotovili so, da je imel 25

51 PECAM-1 na različnih regijah vaskularnega sistema različen vpliv. Podatki sicer podpirajo teorije, da je endotelijski PECAM-1 pomemben anti-aterosklerotični mehanosenzor v aorti, na drugih mestih pa lahko vzpodbuja anti-aterogene odzive (Stevens, et al., 2008). Drugi oteževalni dejavnik je, da je endotelijska sintaza dušikovega oksida (enos) deregulirana v odsotnosti od PECAM-1, tako da imajo miši z izraženim PECAM-1 visoko produkcijo NO, kar zavira vnetje (McCormick, et al., 2011). PECAM-1 je izražen tudi v levkocitih in trombocitih, kjer zavira aktivacijo celic (Patil, et al., 2001). VE-kadherin Druga komponenta mehanosenzornega kompleksa je VE-kadherin. Ta kadherin je specifičen za endotelij, kjer se pojavlja v tesnih medceličnih stikih in prispeva k zmanjšanju žilne prepustnosti. Pomanjkanje tega proteina povzroči embrionalno smrt. V kontekstu mehanotransdukcije VE-kadherin deluje samo kot adapterski protein, ki omogoči vezavo med PECAM-1 in VEGFR2, mehanski razteg proteina pa za razliko od PECAM-1 ne povzroči aktivacije mehanotransdukcijskih poti. VEGFR-2 Tretji član mehanosenzornega kompleksa je VEGFR-2 (receptor vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja 2). Je eden izmed receptorjev, ki vsebuje tirozin kinazo. Njegova aktivacija sproži kaskado dogodkov v celici. Je ključen za embrionalni razvoj, saj tako kot VE-kadherin v primeru pomanjkanja povzroči fetalno smrt (Shalaby, et al., 1995). Tok krvi povzroči od liganda neodvisno aktivacijo tega receptorja, kar sproži kaskado signalnih poti prek Akt in MAPK (Shay-Salit, et al., 2002). Druge signalne poti, ki so odvisne od VEGFR2, vodijo do povečane produkcije NO in aktivacije adapterskega proteina Src (Liu, et al., 2010). 26

52 Slika 9: Potencialni mehanizem sestave mehanosenzornega kompleksa. a) VE-kadherin in PECAM- 1 sta v statičnih pogojih dimerno vezana z istovrstnima proteinoma iz sosednje celice. b) Ko so celice izpostavljene toku krvi, na njih začnejo delovati strižne sile, kar povzroči konformacijsko spremembo PECAM-1, ki veže Src kinazo, ki fosforilira PECAM-1. To povzroči, da VE-kadherin veže VEGFR2, ki ga nato transfosforilira src kinaza, kar sproži signalizacijo signalne poti Akt-protein kinaze B in MAP kinazne ter druge signalne poti. Specifična sestava kompleksa še ni znana. (Conway&Schwartz, 2012). 27

53 7 S STRIŽNO NAPETOSTJO INDUCIRANA SIGNALNA POT DUŠIKOVEGA OKSIDA V ENDOTELIJSKI CELICI Ob izpostavljenosti strižni napetosti EC proizvajajo NO. V našem delu smo že opozorili na pomembno vlogo NO pri uravnavanju toka krvi, vazodilataciji in preprečevanju nastajanja krvnih plakov v notranjosti žilne stene. Mehanska stimulacija produkcije NO vključuje različne mehanosenzorje in encime. Končni cilj je aktivacija endotelijske sinteze NO (enos), ta namreč katalizira oksidacijo aminokisline L-arginin (L-Arg) v citrulin, pri čemer nastaja NO (Balligand, et al., 2009) (Slika 10). Do sedaj je relativno malo poznanega o pomenu in funkcionalnosti vseh mehanotransduktorjev, ki smo jih opisali v prejšnjih poglavjih. Zaradi pomanjkanja informacij večina izmed njih še ni vključena v matematične modele za produkcijo NO. Obstoječi matematični modeli zaenkrat vključujejo le najbolj proučene mehanotransduktorje. To so ionski kanali, receptorji v povezavi z G-proteini in integrini. Podrobno si bomo pogledali matematični model (Sriram, et al., 2016), ki vključuje te tri mehanotransduktorje. Model je zasnovan z namenom napovedovanja dinamike produkcije NO v EC pod vplivom strižnih napetosti. Je primer celostnega modela, ki opisuje proizvodnjo NO v EC. Model temelji na drugih modelih in eksperimentalnih raziskavah (Chachisvilis, et al., 2006; Camerford, et al., 2008; Katsumi, et al., 2005; Plank, et al., 2006; Riccobene, et al., 1999, & Wiesner, et al., 1997). Večina predhodnih modelnih študij je bila osredotočena na dotok kalcijevih ionov v EC pod vplivom strižne napetosti. V teh modelih so bili ionski kanali za Ca 2+ tako mehanosenzor, odgovoren za s strižno napetostjo inducirano endotelijsko proizvodnjo NO (Comerford, et al., 2008). Pomanjkljivost teh modelov je neupoštevanje podrobnosti fosforilacije enos in aktivacije proteinskih kinaz, ki to fosforilacijo sprožajo in regulirajo. V opisanem modelu (Sriram, et al., 2016) se domneva, da je plast EC neprekinjeno napajana z zadostno količino presnovnih substratov za vzdrževanje produkcije endotelijskega NO. Tok krvi ob endotelijski plasti povzroča strižno napetost na zunanji 28

54 površini celične stene, kar sproži zaporedje biokemijskih reakcij (Slika 11), ki na koncu rezultirajo v produkciji NO in relaksaciji gladkih mišičnih celic žil (Slika 10). Slika 10. Signalna pot dušikovega oksida (NO). Pomen oznak: acetilholin (ACh), ciklični adenozin monofosfat (camp), ciklični gvanozin monofosfat (cgmp), črpalka Ca 2+ -ATP-aza v celični membrani (PMCA; angl. plasma membrane Ca 2+ -ATPase), črpalka Ca 2+ -ATP-aza v membrani sarkoplazemskega retikuluma (SERCA), encim fosfataza lahkih verig miozina (MLCP), encim kinaza lahkih verig miozina (MLCK), endotelijska sintaza dušikovega oksida (enos), fosfolamban (PLB), gvanozin trifosfat (GTP), inozitol 1,4,5-trifosfat (IP 3), IP 3-receptorski kanal (IP 3-R) oz. t. i. kanal tipa ICICR (angl. IP 3 and Ca 2+ induced Ca 2+ release), kompleksi Ca 2+ /kalmodulin (Ca 2+ /CaM), L-arginin (L-Arg), molekula kisika (O 2), napetostno odvisni Ca 2+ kanali (VOCC; angl. voltage-operated calcium channels), protein kinaza A (PKA), protein kinaza G (PKG) in topna gvanilat ciklaza (sgc), ioni natrija (Na + ), klora (Cl - ), kalcija (Ca 2+ ) in kalija (K + ). Povzeto po Vajs, Proces se prične z vdorom Ca 2+ v citosol EC in s povišanjem njegove koncentracije, kar povzroči tvorbo kompleksov Ca/CaM. Sledita translokacija enos iz kaveol in njihova fosforilacija z encimoma PKC in Akt. NO aktivira encim topno gvanilat ciklaza (sgc) in sproži produkcijo cikličnega gvanozin monofosfata (cgmp). Ta pa negativno vpliva na prehajanje Ca 2+ v citosol, kar posledično zniža aktivnost enos. NO tudi oddifundira v gladko mišično celico, kjer prav tako sproži produkcijo cgmp. Ob povišani koncentraciji cgmp, ki med drugim aktivira encim proteinska kinaza G (PKG), se zniža povprečna koncentracija Ca 2+, kar vodi v relaksacijo gladke mišične 29

55 celice GMC. cgmp na mehanizme za regulacijo Ca 2+ deluje neposredno ali pa posredno prek PKG. cgmp vpliva tudi na aktivnost encimov MLCK (kinaza lahkih verig miozina) in MLCP (fosfataza lahkih verig miozina) ter na aktivnost črpalk SERCA na SR. Vsi omenjeni mehanizmi zmanjšujejo koncentracijo Ca 2+ v citosolu in vodijo v relaksacijo GMC (Slika 10). 7.1 MATEMATIČNI MODEL SIGNALNE POTI DUŠIKOVEGA OKSIDA V ENDOTELNI CELICI Predvideva se, da se reakcije vršijo v citosolu EC, ki se obravnava kot dobro premešani kontinuum. Gradiente koncentracij se v modelu zanemari. Koncentracije reaktantov so označene z [A] in podane v enotah µm. Modeliranje je sistemsko razdeljeno na mehanizme aktivacije G-proteinov, kalcijeve signalizacije, aktivacije protein kinaz, aktivacije Akt, fosforilacije enos in tvorbe kompleksa enos/ca 2+ CaM, produkcije NO in produkcije cgmp. 30

56 Slika 11: Signalna pot sklopitve strižne napetosti in produkcije NO. Prenos strižne napetosti prek Ca 2+ mehanosenzornih ionskih kanalov (angl. mechanosensing ion channels MSIC), proteinov G in integrinov: 1) Aktivacija integrinov stimulira fosforilacijo PI3K, 2) PI3K+ katalizira fosforilacijo PIP 2 v PIP 3, 3) Zvišanje citosolnega kalcija sproži kapacitivni vnos kalcija skozi kanale na membrani celice (CCE), 4) IP 3 sprosti Ca 2+ iz endoplazemskega retikuluma, 5) Hidroliza PIP 2 v IP 3, stimulirana z aktivacijo proteina G, 6) PIP 3 stimulira prehod encimov Akt in PKC v aktivna stanja, 7) PKC fosforilira enos, ki je vezan v kaveolah (enos cav) na mestu Thr-495, 8) Sproščanje enos cav in tvorba kompleksa Ca 2+ /CaM-eNOS, 9) Aktivna oblika Akt fosforilira enos na Ser-1197, 10) in 11) Produkcija NO iz dveh različnih oblik enos fosforilirane in nefosforilirane, 12) NO stimulira produkcijo cgmp prek aktivacije SGC, 13) Inhibicija CCE z cgmp (Sriram et al., 2016) Aktivacija G-proteinov Strižna napetost deformira celično membrano in s tem aktivira GPCR, ki so transmembranski receptorji. Njihova aktivacija sproži tudi aktivacijo G-proteinov, s katerimi so sklopljeni ti receptorji. Hitrost spreminjanja koncentracije aktiviranih G-proteinov je podana z enačbo: [] =ka[r * ] ([G]t-[G]) - kd[g], (3) kjer je [G] koncentracija aktiviranih G-proteinov, ka in kd sta hitrostni konstanti za prehajanje proteina G v aktivno (ka) oz. neaktivno stanje (kd), [R*] je brezdimenzijski 31

57 delež GPCR, ki je odvisen od strižne napetosti, in [G]t je totalna koncentracija G-proteinov v celici. Odvisnost deleža aktivnih GPCR od strižne napetosti je bila povzeta iz meritev Chachisvilisa, et al., (2006). Te kažejo, da je ob odsotnosti strižne napetosti produkcija IP3 zanemarljiva. Aktivacija GPCR je zelo hitra, zato ni potrebno modeliranje časovnega razvoja. Odvisnost deleža aktivnih receptorjev od strižne napetosti (τ) opisuje enačba: [R * ]= tanh ( ), (4) kjer λ predstavlja strižno napetost, pri kateri je delež aktiviranih GPCR maksimalen. Aktivacija G-proteinov sproži hidrolizo fosfoinozitol 4,5-bisfosfata (PIP2) in tvorbo inozitol trifosfata (IP3). Hitrost produkcije IP3 podaja enačba: [₃] =rf [PIP2] - µ1[ip3], (5) kjer je µ1 hitrostna konstanta razgradnje IP3, rf pa je podan z enačbo: rf =! "cp MATP[G], (6) ki opisuje od količine aktivnega G-proteina [G] odvisno hitrostno konstanto nastajanja IP3. MATP odseva odvisnost procesa od ATP, produkt α Kcp pa podaja maksimalno hitrost nastajanja IP3. Vpliv Ca 2+ na hitrost produkcije IP3 ni eksplicitno upoštevan, kar je v skladu z drugimi modeli (Plank, et al., 2006). Prvi trije členi enačbe (7) opisujejo pretvorbo PIP2 v IP3 in obratno, ostali pa fosforilacijo PIP2 in defosforilacijo PIP3. Hitrost spreminjanja koncentracije PIP2 je povzeta po Lemonu, et al., (2003) in Sedaghatu, et al., (2002) in je: [₂] = - ( rf + rr) [PIP2] - rr [IP3] + rr[pip2t] k + PIP₂ [PIP2] + k - PIP₂ [PIP3], (7) kjer je rr hitrostna konstanta dotoka PIP2, k + PIP₂ in k + PIP₂ pa sta hitrostni konstanti fosforilacije PIP2 oz. defosforilacije PIP3. Hitrostna konstanta rr ima sicer lahko 32

58 vrednosti od 0,015 s -1 do 10 s -1 (Lemon, et al., 2003), a so končni rezultati dokaj neobčutljivi na vrednost tega parametra. Fosforilacijo PIP2 v PIP3 katalizira aktivna oblika fosfoinozitid 3-kinaze (PI3K) v skladu z enačbo (Sedaghat, et al., 2002): [₃] = k + PIP₂ [PIP2] - k - PIP₂ [PIP3] (8) Katalitična aktivnost PI3K je odvisna od nivoja strižne napetosti in je nadaljnje obravnavana v podpoglavju Kalcijeva signalizacija Strižna napetost povzroči odprtje ionskih kanalov za Ca 2+ na membrani EC. Ta povzroči vdor Ca 2+ iz zunajcelične raztopine v notranjo, hkrati pa se Ca 2+ v citosol izloči tudi iz znotrajcelične shrambe, tj. sarkoplazemskega retikuluma (SR). Časovna odvisnost spreminjanja totalne koncentracije Ca 2+ v citosolu (+,-. /0 + [,-. ]1) in koncentracija kalcija v (SR) ([,-²+]4) opišemo z naslednjima diferencialnima enačbama (Camerford, et al., 2008; Plank, et al., 2006; Wiesner, et al., 1997): 5([67 8 +]9. [67²+]:) =qrel qres qout+qin+qleak (9) 5[67²+]E =-Vr (qrel qres qleak), (10) kjer je Vr razmerje volumnov citosola in SR, [Ca 2+ ]c koncentracija prostega kalcija v citosolu, [Ca 2+ ]b je koncentracija kalcija, vezanega na citosolne proteine, in [Ca 2+ ]s je koncentracija prostega kalcija v SR. Kalcij se v citosolu veže tudi na vezavne proteine in z njimi disociira, kot opisuje enačba: [67²+]J = kon [Ca 2+ ]c ([Btot] - [Ca 2+ ]b) koff[ca 2+ ]b, (11) kjer je [Btot] totalna koncentracija vezavnih mest za Ca 2+ na citosolnih proteinih, kon in koff pa sta hitrostni konstanti vezave in disociacije Ca 2+ na proteine. 33

59 V enačbah (9) in (10) členi qi predstavljajo pritekajoče in odtekajoče tokove Ca 2+ v oz. iz posamezne shrambe. qrel je tok Ca 2+ iz SR skozi od IP3 odvisne kanale po mehanizmu ICICR (angl. IP3 and Ca 2+ induced Ca 2+ release): qrel = krel K [₃] L₂.[₃] MN [Ca 2+ ]s, (12) kjer je krel hitrostna konstanta, k2 je konstanta polovične zasičenosti in [IP3] je koncentracija IP3 v citosolu. qres je tok Ca 2+ iz citosola v SR prek črpalk za Ca 2+ (SERCA). qres = kres K [67²+]9 L₃.[67²+]9 M, (13) kjer je kres maksimalna aktivnost črpalk in k3 konstanta polovične zasičenosti. qleak predstavlja pasivni tok Ca 2+ iz SR v citosol. qleak = kleak [Ca 2+ ]s 2, (14) kjer je kleak hitrostna konstanta prepustnosti membrane SR. qout predstavlja tok Ca 2+ iz citosola v zunajcelično raztopino skozi izmenjevalce za Na + in Ca 2+ : qout = kout [67²+]9 L₅.[67²+]9, (15) kjer je kout maksimalna aktivnost izmenjevalca Na + /Ca 2+ in k5 konstanta polovične zasičenosti. qin predstavlja vsoto tokov Ca 2+ iz zunajceličnega medija v citosol skozi kapacitivne kanale za Ca 2+ (angl. capacitive Ca 2+ entry CCE) in toka skozi ionske kanale, ki so občutljivi na mehanske obremenitve (angl. mechanosensing ionic channels MSIC). qin = qcce + qmsic, (16) kjer je qmsic definiran kot linearno odvisen od deleža odprtih ionskih kanalov (f0), ki je odvisen od strižne napetosti (τ): 34

60 qmsic = f0(τ)qmax, (17) kjer je qmax maksimalni tok skozi tovrstne kanale, f0(τ) pa je podan kot: f0(τ) = T.UV T WX(Y), (18) kjer je W(τ) količina, ki podaja mero za to, kolikšen delež strižne napetosti se pretvarja v aktivacijsko energijo, ki je potrebna za odprtje ionskih kanalov tipa MSIC: (Z. [T\]². ]²^ ] )² W(τ) = W0 Z. [T\] 8, (19). ]² kjer je W0 maksimalna vrednost, ki se zaradi strižne napetosti lahko pretvori v aktivacijsko energijo za odprtje MSIC, τ je strižna napetost in χ je strižni modul membrane. Tok prek kapacitivnih kanalov za Ca 2+ je odvisen od koncentracije Ca 2+ v SR, hkrati pa naj bi bil tok odvisen tudi od koncentracije CGMP v citosolu celice ([CGMP]), kot podaja enačba: qcce = kcce ψ ([cgmp])( [Ca 2+ ]s,0- [Ca 2+ ]s)( [Ca 2+ ]e-[ca 2+ ]c), (20) kjer je kcce hitrostna konstanta, [Ca 2+ ]s,0 je konstantna koncentracija Ca 2+ v SR v mirovnem stanju celice, [Ca 2+ ]e je konstantna koncentracija Ca 2+ v zunajcelični raztopini, faktor ψ ([cgmp]) pa predstavlja faktor vpliva CGMP na odprtost teh kanalov in je podan z linearno odvisnostjo: ψ = ξ[cgmp], (21) kjer je ξ sorazmernostni faktor. Vpliv CGMP na kanale tipa MSIC v modelu ni upoštevan, čeprav naj bi ostajali nekateri podatki o tem (Kwan, et al., 2000) Aktivacija fosfoinozotid 3-kinaze (PI3K) Integrini, ki zasidrajo EC na zunajcelični matriks, so vezani na adhezijska mesta znotraj EC in delujejo kot mehanotransduktorji. Aplicirana sila povzroči fosforilacijo tirozina adhezijskih kinaz (FAK), kar sproži stimulacijo PI3K. V EC so ta proces 35

61 proučevali in vitro, kjer so merili aktivacijo integrinov, FAK in PI3K, v odvisnosti od mehanske stimulacije (Katsumi, et al., 2005). Po izpostavljenosti strižni napetosti hitro poteče fosforilacija PI3K, ki doseže maksimum v času 10 s (Go, et al., 1998). Ta proces se sproži ob aktivaciji kompleksa FAK/Src prek integrinov, ki služijo kot pretvorniki sile, ki regulirajo mehanski signal. Ker je časovna skala fosforilacije in s tem aktivacije PI3K velikostni red manjša kot pri drugih kemijskih reakcijah v obravnavanem modelu (ki se običajno pojavijo v časovni skali med 1 in 100 min), se lahko zanemari časovni zamik med trenutkom stimulacije z mehansko silo in aktivacijo PI3K. Strižna napetost torej v trenutku sproži aktivacijo PI3K. Aktivna oblika PI3K, tj. PI3K *, se nato postopoma vrne v svojo osnovno raven aktivnosti. Delež aktivne oblike encima PI3K ob stimulaciji s strižno napetostjo glede na bazalno stanje je podan z izrazom: [N_ ] [N_ ]:7E = 1 + api3k tanh KZ a M e-ηt, (22) kjer je [PI3K * ] koncentracija aktivne oblike PI3K ob stimulaciji, [PI3K * ]bas je koncentracija PI3K v mirnem stanju, τ je strižna napetost, t je čas, parametri αpi3k, δ in η pa so bili določeni z meritvami (Go, et al., 1998; Katsumi, et al., 2005). V enačbi (22) je različna hitrost deaktivacije PI3K do bazalne vrednosti simulirana z različnimi vrednostmi parametra η. Po izpostavljenosti strižni napetosti [PI3K] lahko doseže maksimalno 3,5-kratnik svoje bazalne vrednosti (Katsumi, et al., 2005). To v enačbi (2) definira vrednost αpi3k =2,5. V delu so raziskane vrednosti parametra η od 0,03 s -1 (zelo hiter razpad aktivnosti PI3K) do 0 (ni razpada). Raziskane so tudi vrednosti δ, ki ustrezajo strižni napetosti, pri kateri se pojavi maksimalna aktivacija PI3K. Predstavljeni model se je izkazal za relativno neodvisnega od δ. Pri vseh stimulacijah je bila uporabljena vrednost δ = 24 dynes/cm 2. Modelne napovedi so relativno nesenzitivne na variacije v vrednosti δ. To nakazuje, da so predhodni vplivi aktivacije PI3K na produkcijo NO zanemarljivi. Aktivacija PI3K poviša hitrost fosforilacije PIP2 v PIP3 (Sedaghat, et al., 2002), kar je opisano z enačbo (8). Parameter, ki opisuje hitrost fosforilacije v tej enačbi, je podan kot: 36

62 k + [N_ ] PIP₂ = k1p [N_ ]b7c + k2p, (23) kjer je [PI3K * ]max maksimalna koncentracija aktivne oblike PI3K* in je podana s pogojem: [PI3K * ]max=[pi3k * ]bas (1 +! N_ ) (24) Iz tega sledi: k + LTd PIP₂ = [1+! T.e N_ e -ηt tanh K Ƭ M] + k2p, (25) fghi a kjer sta k1p in k2p hitrostni konstanti. PIP3 regulira prehod kinaz Akt in PKC, ki fosforilirata enos (Sedaghat, et al., 2002) v aktivno obliko. Proces aktivacije Akt in PKC je modeliran z enačbama: [kl ] = l. kl [Akt] l ^ kl [mln ], (26) [_6 ] = l. ^ _6 [PKC] l _6 [o", ], (27) kjer je [mln ] koncentracija aktivne oblike Akt, [Akt] koncentracija neaktivne oblike Akt, [o", ] koncentracija aktivne (fosforilirane) oblike PKC, [PKC ] koncentracije neaktivne oblike PKC. Veljata tudi ohranitveni enačbi za Akt in PKC: [Akt]+[Akt * ] = [Akt]tot, (28) [PKC]+[PKC * ] = [PKC]tot, (29) Vrednosti parametrov v enačbah (26 29) so odvisne od [PIP3] (Sedaghat, et al., 2002): l. ^ kl = 0.1l kl [N]^[N] qrs [N] qtu^[n] qrs, (30) l ^ ^ _6 = 0.1l _6 [N]^[N] qrs [N] qtu^[n] qrs, (31) kjer sta k - Akt in k - PKC hitrostni konstanti, minimalna in maksimalna koncentracija PIP3 pa sta podani kot: 37

63 [PIP3]min = [PIP2]tot, (32) [PIP3]max = 0.031[PIP2]tot, (33) Fosforilacija in formiranje različnih kompleksov enos enos tvori s kalmodulinom (CaM) različne komplekse enos/cam, pri čemer je na CaM vezano različno število ionov Ca 2+. Od vseh kompleksov Ca 2+ /CaM je v modelu obravnavana le vloga Ca4/CaM, saj ta glede na ostale komplekse močno prevladuje tako v smislu citosolne koncentracije (Park, et al., 2008) kot afinitete do enos (McMurry, et al., 2011). Časovni potek kompleksa Ca4/CaM je podan z enačbo: [vw₄^vwy] [67 8~ ] = l 67z^67{ θ L tƒ. [67 8~ [,- ] [Ca₄ CaM], (34) ] kjer je β Hillov koeficient za vezavo Ca 2+ na prosto obliko CaM v citosolu, KdCaM je disociacijska konstanta oz. konstanta polovične zasičenosti, kca4-cam je hitrostna konstanta reakcije, [CaM]tot je totalna koncentracija CaM v citosolu, koeficient θ pa določa limitno vrednost koncentracije kompleksa Ca4/CaM v stacionarnem stanju ob visokih koncentracijah kalcija v citosolu. Proces aktivacije enos od neaktivne oblike pa do polno aktivne oblike (ko je fosforiliran Ser-1197), je modeliran v treh korakih (Balligand, et al., 2009; Dudzinski, et al., 2006; Mount, et al., 2007; Takahashi, & Mendelsohn, 2003): 1. korak: na kaveolin vezan enos (enoscav) tvori kompleks s Ca4/CaM, ki je označen z enos/cam. Hitrost tvorbe tega kompleksa je modeliran z Michelis- Mentenino kinetiko: [ˆ Š ^vwy] = ~ L tƒ [67₄67{] [enoscav] l ^ L Œ.Ž tƒ.[67₄67{] 67{ [enos-cam] - [ˆU ^67{ ], (35) kjer sta k + CaM in k - CaM hitrostni konstanti, k0.5cam pa je Michelis-Mentenina konstanta. ^ Hitrost disociacije kompleksa enos/cam (l 67{ 38 = 0,01 s -1 ) je določena na podlagi vrednosti, opredeljenih v delu McMurryja, et al., (2011). Maksimalna vrednost, pri kateri se enos veže na CaM v prisotnosti kaveolina, je bila ocenjena na podlagi

64 predvidevanj bazalnih pogojev, da je 90 % enos v neaktivni, nevezani obliki. To. določa vrednost l 67{ = 7,5 s -1. Vrednost l, 67{ = 3,0 μm je bila določena iz podatkov Michela, et al., (1997). 2. korak: kompleks enos/cam se stabilizira prek fosforilacije na Ser Hitrost fosforilacije regulira količina aktivne oblike Akt. Mehanizem je opisan z linearno kinetiko: [VU ^97{ ]. ^ = l VkL [enos-cam] l VkL t [enos-,- ], (36). kjer je l VkL podan kot:. l VkL = l b7c kl [mln ]/[Akt]tot, (37) kjer je [Akt * ] količina aktivne oblike Akt in [Akt]tot pripadajoča totalna koncentracija. ^ l VkL in l b7c kl sta hitrostni konstanti. Vrednosti parametrov temeljijo na meritvah Takahashij, & Mendelson (2003). Stabilni kompleks enos/cam * je bistveno bolj aktiven kot enos/cam v smislu produkcije NO (Balligand, et al., 2009; Dudzinski, et al., 2006; Mount, et al., 2007; Takahashi, & Mendelsohn, 2003). 3. korak: od PKC odvisna fosforilacija enoscav na Thr-495 inhibira proces vezave CaM na enos in s tem njegovo aktivacijo (Balligand, et al., 2009). Časovno odvisnost inhibirane (tj. na Thr-495 fosforilirane) in na kaveolin vezane oblike enos ([enos 0 cav]) opisuje enačba: [ 0- ]. [_6 = = l ] š œ [ [_6] 97Ÿ ] k - Thr [ 97Ÿ ], (38) ž kjer sta k + Thr in k - Thr hitrostni konstanti, [PKC * ]/[PKC]tot je delež aktivne oblike PKC in [enoscav] je na CAV vezana nefosforilirana oblika enos. Velja še ohranitvena enačba za enos: [enoscav] + [enos 0 cav] + [enos-cam] + enos-cam*] = [enos]tot, (39) Vrednost [enos]tot znotraj celice je 0,04 μm (Chen, et al., 2006). 39

65 7.1.5 Produkcija dušikovega oksida Aktivni obliki enos (enos/cam in enos/cam*) sta zmožni katalizirati oksidacijo L-Arg. Rezultat tega je produkcija NO. Časovna odvisnost hitrosti spreminjanja koncentracije NO je podana z enačbo: [U ] = QNO QsGC λno[no], (40) kjer je QNO hitrost produkcije NO, QsGC hitrost vezave NO na topno gvanilat ciklazo (sgc), zadnji člen v enačbi pa predstavlja razgradnjo oz. vezavo NO v rdečih krvnih celicah. Za hitrost produkcije QNO je uporabljena Michaelis-Mentenina kinetika: U = U [ 8 ] L q. [ 8 ], (41) kjer je kmno Michaelis-Mentenina konstanta reakcije, RNO maksimalna hitrost produkcije NO in [ ] konstantna koncentracija substrata v tej reakciji, tj. kisika. Vrednost RNO je odvisna od koncentracije fosforiliranega oz. nefosforiliranega kompleksa enos/cam in je podana z enačbo: RNO = keno ([enos-cam] + θ[enos-,- ]), (42) kjer θ predstavlja večkratnik, za katerega fosforilacija Akt poviša aktivacijo enos v primerjavi z nefosforilirano obliko. Predvideva se, da je razmerje keno[o2]/(kmno + [O2]) konstantno. Pri fizioloških vrednostih strižne napetosti (τ 20 dynes/cm 2 ) je hitrost produkcije NO okoli 20 μm/s. Eksperimentalni podatki (Ahluwalia, et al., 2004; Dimmeler, et al., 1999; Schmidt, et al., 2005) kažejo, da je v EC prisotna gvanilat ciklaza (GC), ki ob vezavi NO producira cgmp iz GTP. Ta proces opisuje naslednji izraz, ki je povzet po Condorell, & George (2001): b7c [U ] QsGC = 8.: [U ] U 7 Œ.7 [U ]. [U ] 8 [sgc], (43) kjer so 1 T, -, - T ustrezni parametri, b7c U pa je maksimalna hitrost vezave NO. Vrednost koncentracije sgc je ocenjena na 0,1 μm. Vrednost je bila pridobljena iz skupne koncentracije proteinov v celici, ki je približno 0, proteinov na μm 3 (Milo, 40

66 2013). Ocenjeno je, da ima sprememba [sgc], ki je manjša od 1 %, zanemarljiv vpliv na [NO]. Hitrost spreminjanja koncentracije cgmp je izražena kot funkcija koncentracije NO (Condorelli, & George, 2001). Upoštevana je tudi poraba oz. razpad cgmp: [ y ] b7c = Œ. [ Š].[ Š]² - [ y ]², (44) 9{ 7 Œ.7 [ Š].[ Š]² L ªƒf. [ y ] b7c kjer je 9{ maksimalna hitrost produkcije cgmp, «, «T, - in - T so ustrezne konstante, kcgmp je konstanta polovične zasičenosti in X maksimalna hitrost porabe oz. razpada cgmp. V modelu so uporabljene vrednosti modelnih parametrov, ki so podane v Tabeli 1, razen če ni drugače določeno. Te vrednosti parametrov ponazarjajo normalno fiziološko stanje sistema. Nekatere vrednosti parametrov so bile prilagojene tako, da se rezultati modela dobro ujemajo z meritvami. To primerjavo bomo predstavili v naslednjem poglavju. 41

67 Tabela 1: Vrednosti modelnih parametrov. (Guan, 1997; Sriram, 2011; Johnson, 2011; Lemon, 2003; Martinac, 2004; Wiesner, 1996; Nollen, 2002; Dimmeler, 1998; Ozeki, 2004; Creager, 2003; Chen, 2006). Parameter Vrednost Parameter Vrednost k α 0,017 s -1 k d 0,15 s -1 μ 1 0,2 s -1 α 8,37 s -1 λ 15 dynes/cm 2 K dcam 1 μm r r 10 s -1 k - PIP₂ 0,7024 s -1 V r 3,5 q max 17,6 μms -1 k rel 6,64 s -1 k res 5 μm -1 k out 24,7 μms -1 k CCE 8 x 10-7 k 2 0,2 μm k 3 0,15 μm k 5 0,32 μm k off 300 s -1 k on 100 μm -1 s -1 k leak 10-7 μm -1 s -1 χ 28,6 dynes/cm 2 α PI3K 2,5 η 0,003 s -1 δ 24 dynes/cm 2 k 1p 0,021 s -1 k 2p 0,022 s -1 ^ l kl 0,1155 s -1 k - PKC 0,1155 s -1 k + Thr 0,002 s -1 k - Thr 2,22 x 10-4 s -1 k Ca4-CaM 100 s -1 β 2,7 θ 0,0045 K + CaM 7,5 s -1 K 0.5CaM 3 μm K - CaM 0,01 s -1 k max e Akt 0,004 s -1 k - e Akt 2,22 x 10-4 s -1 λ NO 382 s -1 ϒ 300 s -1 Ø 9 R max NO 0,022 s -1 b 1 15,15 nm N 2 a ,16 nm 2 a 1 37,33 nm g 0 4,8 nm 2 g 1 35,33 nm X 0,0695 s -1 K cgmp 2 μm V max cgmp 1,26 μm s -1 [CaM] tot 30 μm [Ca 2+ ] e μm [G t] 0,33 μm [PIP 2t] 10 μm [enos] tot 0,04 μm K cp 0,002 μm -1 SGC0 0,1 μm M ATP 0,7937 [Ca 2+ ] s μm ξ 0,0075 μm -1 B tot 120 μm 42

68 7.2 PRIMERJAVA REZULTATOV MODELA IN MERITEV Napovedi predstavljenega modela v nadaljevanju primerjamo z meritvami. Ključna napoved modela je hitrost proizvodnje NO v odvisnosti od strižne napetosti, ki jo je možno primerjati z rezultati meritev. V primeru, da se modelna napoved ujema z meritvami, je nato s tem modelom možno napovedovati različne druge rezultate, ki pa niso neposredno primerljivi z izmerjenimi količinami. V tem smislu imajo ta in podobni biofizikalni modeli veliko napovedno moč in lahko usmerjajo delo tistih, ki opravljajo meritve. Validacija tega modela je bila izvedena na dveh ravneh (Sriram, et al., 2016): 1. model je moral napovedati in reproducirati realistične vrednosti produkcije NO v odvisnosti od strižne napetosti v stacionarnem stanju sistema, 2. model je moral napovedati in reproducirati meritve časovne odvisnosti produkcije NO. Modelna spremenljivka, ki se jo primerja z rezultati meritev, je hitrost produkcije NO oz. hitrost izločanja NO iz endotelnih celic. Ker se NO hitro metabolira, navadno ni mogoče neposredno meriti koncentracije NO ali hitrosti njegove produkcije, temveč se merijo koncentracije njegovih metabolitov, tj. nitritov in nitratov (NOX), ki se akumulirajo v krvi. Ker je v modelu hitrost metabolizma NO (QsGC) zelo majhna v primerjavi s hitrostjo produkcije (QNO), je hitrost proizvodnje NO v endotelni celici kar enaka hitrosti izločanja NO v kri, kjer pa se hitro veže in metabolira. Na podlagi tega privzetka je med seboj možno primerjati modelno napoved hitrosti produkcije NO in izmerjeno vrednost hitrosti akumulacije metabolitov NO v krvi (NOX). Slika 12A prikazuje primerjavo normalizirane modelne napovedi hitrosti produkcije NO v stacionarnem stanju (QNO) v odvisnosti od strižne napetosti (polna črta) izmerjeni vrednosti hitrosti akumulacije metabolitov NO v krvi pri različnih vrednostih strižne napetosti (simboli,, ). Meritve so povzete iz treh različni referenc: Kaur, et al., (2012) (simbol ), Kuchan, & Frangos, (1994) (simbol ), Kanai, et al., (1995) (simbol ). Meritve, prikazane s simbolom, prikazujejo vrednosti hitrosti akumulacije NOX, meritve, prikazane s simbolom, prikazujejo meritve hitrosti 43

69 akumulacije nitritov, meritve, prikazane s simbolom, pa neposredne meritve hitrosti produkcije NO. Vse vrednosti (izmerjene in izračunane) so normalizirane na vrednost 1 pri strižni napetosti 0 (τ = 0). Iz Slike 12A je razvidno, da se modelna napoved dobro ujema z meritvami, ki pa se tudi med seboj malenkostno razlikujejo. Slika 12: A) Normirana produkcija NO v stacionarnem stanju v odvisnosti od strižne napetosti. Modelna napoved (krivulja) in izmerjene vrednosti (simboli) produkcije NO od strižne napetosti. Z modelom izračunane vrednosti podaja Q NO v enačbi (26). B) Normirana produkcija NO v odvisnosti od časa pri različnih vrednostih strižne napetosti. Modelna napoved pri τ = 12 dynes/cm 2 (polna črta), modelna napoved pri τ = 0 (črtkana črta), izmerjene vrednosti pri τ = 0 (krog) in izmerjene vrednosti pri τ = 12 dynes/cm 2 (kvadrat) kumulativne sprostitve NO v krvni obtok kot funkcije časa (Sriram et al., 2016). Na Sliki 12B je prikazana časovna odvisnost normalizirane kumulativne količine NO, ki se izloči iz endotelnih celic. Vrednost je izračunana kot integral po času od neto hitrosti produkcije NO (hitrost produkcije NO hitrost metabolizma NO) v endotelni celici (enačba 40). Časovni odvisnosti sta izračunani za primera, ko je strižna napetost 12 dynes/cm 2 (polna črta) in ko strižne napetosti ni (črtkana črta). Točke na grafu predstavljajo izmerjene vrednosti. Vse vrednosti na grafu so normalizirane tako, da kumulativna vrednost izločenega NO po 24 urah ob strižni napetosti 12 dynes/cm 2 predstavlja vrednost 1. Primerjava z modelom izračunane časovne odvisnosti se dobro sklada z izmerjenimi vrednostmi. Slika 13A prikazuje primerjavo z modelom izračunanih in izmerjenih vrednosti absolutne koncentracije NO v stacionarnem stanju za tri vrednosti strižne napetosti (τ). 44

70 Izračunane in izmerjene vrednosti se razlikujejo za manj kot 5 % in odražajo približno linearno zvezo med stacionarno koncentracijo NO in strižno napetostjo znotraj fizioloških vrednosti strižne napetosti. V poenostavljenih modelih mikrocirkulacije se večinoma uporablja kar linearna zveza med tema dvema spremenljivkama (Sriram, et al., 2016). Slika 13B prikazuje primerjavo izračunanih in izmerjenih vrednosti (Andrews, et al., 2010) dviga koncentracije NO nad bazalno vrednost v stacionarnem stanju pri treh različnih vrednostih strižne napetosti (τ). Tudi v tem primeru je razlika med modelom in meritvijo zelo majhna in ni večja od 10 %. Slika 13: A) Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti koncentracije NO pri treh različnih vrednostih striže napetosti. B) Primerjava izračunanih in izmerjenih vrednosti dviga koncentracije NO nad bazalno vrednosti, pri treh različnih vrednostih strižne napetosti (Mashour & Boock, 1999). 7.3 NAPOVEDI MODELA S predstavljenim modelom je moč napovedati tudi časovne odvisnosti posameznih spremenljivk, ki jih v eksperimentih ni moč neposredno izmeriti. Take napovedi so še posebej pomembne, saj lahko usmerjajo meritve, pokažejo, kako se posamezne spremenljivke odzivajo na motnje, kateri procesi so hitrejši in kateri počasnejši itd. Eden takih rezultatov je, kako se npr. količina aktivne oblike enos, na katero je vezan protein CaM, odziva na kalcijev signal, ki ga sprožijo različne strižne napetosti (τ). Pogledali si bomo tudi dinamiko citosolnega kalcija ([Ca 2+ ]c), shranjenega kalcija ([Ca 2+ ]s), kompleksa kalcij kalmonodulin (Ca4/CaM) in kompleksa enos/cam pri različnih vrednostih strižne napetosti. Povišanje stopnje strižne napetosti τ ob času t = 0 povzroči hiter izpust kalcija v citosol. To se kaže v naglem povišanju koncentracije 45

71 kalcija, ki mu sledi postopno znižanje na stacionarno vrednost, ki presega bazalno vrednost pred stimulacijo (Andoi, & Yamamoto, 2009; Comerford, et al., 2008; Wiesner, et al., 1997). To je t. i. dvofazni signal v citosol ([Ca 2+ ]c), ki je prikazan na Sliki 14A za tri različne vrednosti strižne napetosti τ = 8 dynes/cm 2 (polna črta), τ = 16 dynes/cm 2 (prekinjena črta), τ = 24 dynes/cm 2 (črtkana črta). Za enake vrednosti strižne napetosti so izračunane še časovne odvisnosti koncentracije Ca 2+ v SR ([Ca 2+ ]s) (Slika 14B), kompleksa Ca4/CaM (Slika 13C) in kompleksa enos/cam (Slika 13D). Slika 14: Variabilnost koncentracij. Trenutna variabilnost koncentracij citosolnega kalcija, [Ca 2+ ] c, shranjenega kalcija [Ca 2+ ] s in Ca 4/CaM ter enos/cam kompleksov, za strižno napetost 8, 16 in 24 dyn/cm 2 (Comerford et al., 2008). Iz simulacij je razvidno, da stopničasta sprememba strižne napetosti povzroči kratkotrajni dvig koncentracije Ca 2+ v citosolu, kar je posledica vdora Ca 2+ v citosol prek membrane SR in celične membrane prek mehanizma CCE. Ca 2+ se pri tem veže na CaM, zato se zviša koncentracija kompleksa Ca4CaM. Slednji se veže na enos in aktivira encim. Vse to se kaže v povišani proizvodnji NO. V tej od Ca 2+ odvisni signalni poti pa imajo pomembno vlogo tudi proteinske kinaze, ki se aktivirajo ob povišani strižni napetosti in posredno vplivajo na signalno pot Ca

72 7.4 NAPOVED VPLIVA INHIBICIJ RAZLIČNIH PROTEINSKIH KINAZ NA PRODUKCIJO NO Za podrobnejše razumevanje delovanja posameznega encima in celotne signalne poti, v kateri je encim udeležen, pogosto v eksperimentih inhibirajo delovanje tarčnega encima ali pa inhibirajo druge encime, ki imajo neposredni ali posredni vpliv na tarčni encim. V našem primeru je ta tarčni encim enos, druga encima, ki pa neposredno vplivata na njegovo aktivnost, pa sta Akt in PKC, ki fosforilirata encim enos in ga tako aktivirata. Encim PI3K pa vpliva na aktivnost encimov Akt in PKC, kar ima posreden vpliv na aktivnost enos. Rezultat modela za primer, ko je enos fosforiliran z Akt, se dobro ujema z meritvijo Dimmelerja, et al., (1999). Primerjava je prikazana v prvih dveh stolpcih Slike 15A za vrednost strižne napetosti 12 dynes/cm 2. Vrednost je izražena relativno glede na bazalno vrednost pri τ = 0. Slika 15: Vpliv modulacije aktivnosti proteinskih kinaz na produkcijo NO (Dimmeler et al., 1999). Za podrobnejši opis slike glej besedilo. Drugi par stolpcev na Sliki 15A prikazuje primerjavo modela in meritve za primer, ko je enos fosforiliran z Akt, vendar je pri tem inhibiran encim PI3K. Izkaže se, da ima inhibicija encima PI3K velik vpliv na produkcijo NO, saj se ob inhibiciji PI3K ta v modelu zmanjša približno za faktor 5, v eksperimentu pa v povprečju približno za faktor 2,5. Pri tem je treba poudariti, da so napake meritve dokaj visoke in znašajo približno 30 % izmerjene vrednosti, kar pomeni, da je napoved modela znotraj napak meritve. Pari stolpcev 3 5 na Sliki 15A pa prikazujejo primerjavo modelne napovedi 47