UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO AGATA PETRIČ VPLIV RESVERATROLA NA SINTEZO NEVROTROFINA-3 V ASTROCITIH NOVOROJENIH PODGAN

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO AGATA PETRIČ VPLIV RESVERATROLA NA SINTEZO NEVROTROFINA-3 V ASTROCITIH NOVOROJENIH PODGAN UNIVERZITETNI ŠTUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2015

2 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO AGATA PETRIČ VPLIV RESVERATROLA NA SINTEZO NEVROTROFINA-3 V ASTROCITIH NOVOROJENIH PODGAN THE INFLUENCE OF RESVERATROL ON NEUROTROPHIN-3 SYNTHESIS IN NEONATAL RAT ASTROCYTES Ljubljana, junij 2015

3 Diplomsko nalogo sem opravljala na Inštitutu za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani, pod mentorstvom prof. dr. Mojce Kržan, dr. med. in somentorstvom znan. sod. dr. Damjane Mojce Jurič, univ. dipl. kem. Zahvala Mentorici prof. dr. Mojci Kržan se zahvaljujem za možnost opravljanja diplomske naloge na Inštitutu za farmakologijo, somentorici znan. sod. dr. Damjani Mojci Jurič pa za vso strokovno podporo, nasvete in usmerjanje pri opravljanju diplomskega dela. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom prof. dr. Mojce Kržan, dr. med. in somentorstvom znan. sod. dr. Damjane Mojce Jurič, univ. dipl. kem. Agata Petrič

4 KAZALO VSEBINE KAZALO SLIK... IV POVZETEK... V ABSTRACT... VI SEZNAM OKRAJŠAV... VII 1 UVOD Resveratrol Biokemijske lastnosti resveratrola Farmakokinetične lastnosti resveratrola Spodbujanje biološke uporabnosti resveratrola Farmakološki učinki resveratrola Astrociti Vloga astrocitov Nevrotrofini Nevrotrofin Receptorji za NT Razporeditev NT-3 in TrkC Vloga NT Uravnavanje sinteze NT Resveratrol in astrociti NAMEN DELA MATERIALI IN METODE Materiali Za pripravo celičnih kultur Spojine za tretiranje celičnih kultur Za encimsko-imunsko metodo Poskusne živali II

5 3.2 Metode Gojišča in pufri Priprava astrocitov Tretiranje primarnih celičnih kultur Priprava vzorcev za encimsko-imunske poskuse Določitev celokupnih proteinov v vzorcih Encimsko-imunska metoda za kvantitativno določanje NT Statistična obdelava podatkov REZULTATI Koncentracijska in časovna odvisnost sinteze NT-3 v astrocitih pod vplivom resveratrola Receptorski mehanizmi, preko katerih resveratrol spodbuja sintezo NT-3 v astrocitih Znotrajcelične poti, preko katerih resveratrol spodbuja sintezo NT-3 v astrocitih RAZPRAVA SKLEP LITERATURA III

6 KAZALO SLIK Slika 1: Izomere resveratrola Slika 2: Zaščitno delovanje resveratrola Slika 3: Nevrovaskularna enota Slika 4: Vezava NT-3 na TrkC receptor in aktivacija znotrajceličnih signalnih poti...11 Slika 5: Vpliv različnih koncentracij resveratrola na časovno odvisnost celične vsebnosti NT Slika 6: Vpliv različnih koncentracij resveratrola na časovno odvisnost sproščanja NT-3 iz astrocitov podgane Slika 7: Vpliv neselektivnega in selektivnih antagonistov ER in ER na sintezo NT-3, spodbujeno z resveratrolom Slika 8: Vpliv različnih koncentracij selektivnih antagonistov ER in ER na vsebnost NT-3, spodbujeno z resveratrolom Slika 9: Vpliv 17ß-estradiola inselektivnih agonistov ER in ER na vsebnost NT-3 v astrocitih Slika 10: Vpliv inhibitorjev PKC in CaMKII na sintezo NT-3, spodbujeno z resveratrolom Slika 11: Vpliv inhibitorja PKA na sintezo NT-3, spodbujeno z resveratrolom Slika 12: Vpliv inhibitorja PI3K na sintezo NT-3, spodbujeno z resveratrolom Slika 13: Vpliv inhibitorja MAP kinazne kaskade na sintezo NT-3, spodbujeno z resveratrolom Slika 14: Strukturna podobnost resveratrola z dietilstilbestrolom in estradiolom IV

7 POVZETEK Resveratrol je rastlinski fitoestrogen, ki je obetavno terapevtsko sredstvo za preprečevanje in zdravljenje nevrodegenerativnih obolenj. Prehaja krvno-možgansko pregrado, uravnava delovanje živčnih celic in je pomemben modulator funkcije astrocitov. Nevrotrofični dejavnik nevrotrofin-3 (NT-3) omogoča preživetje in diferenciacijo živčnih celic različnih fenotipov in sodeluje pri procesih sinaptične plastičnosti. Astrociti predstavljajo pomemben lokalni vir NT-3, kjer njegovo sintezo uravnavajo različni dejavniki. Vpliv resveratrola na sintezo NT-3 ni poznan, zato smo v pričujoči nalogi proučili možno aktivno vlogo tega fitoestrogena pri spodbujanju sinteze in sproščanja NT- 3 iz astrocitov. Študija je potekala na primarnih celičnih kulturah astrocitov možganske skorje podgane. Celice smo izpostavili vplivu resveratrola, agonistom in antagonistom estrogenskih receptorjev ter različnim zaviralcem znotrajceličnih signalnih poti. S specifično encimsko-imunsko metodo za kvantitativno določanje NT-3 proteina smo določili znotrajcelično vsebnost in sproščanje NT-3 iz astrocitov. Spodbudni vpliv resveratrola na sintezo NT-3 je hiter in prehoden ter odvisen od koncentracije in časa inkubacije celic v prisotnosti te snovi. Najučinkovitejši je pri koncentraciji 100 nm, ki po 12-urni inkubaciji povzroči 3-kratno povišanje znotrajcelične vsebnosti NT-3, 12 ur kasneje pa tudi 2,5-kratno povečanje sproščanja NT-3 v primerjavi s kontrolnimi celicami. Z uporabo agonistov (17ß-estradiol, PPT in DPN) in antagonistov (ICI 182,780, MPP, PHTPP) estrogenskih receptorjev smo ugotovili, da je sinteza astrocitnega NT-3 pod vplivom resveratrola receptorski proces, kjer sta aktivno udeležena oba podtipa estrogenskih receptorjev, ER in ERβ. K vplivu resveratrola pomembno prispeva dvig znotrajceličnega Ca 2+ in aktivacija PKC in CaMKII, aktivacija encimapi3k in serin/treonin protein kinaze Akt ter aktivacija MAP kinazne kaskade, ki predstavlja konvergenčno točko omenjenih znotrajceličnih poti. Na podlagi dobljenih rezultatov zaključujemo, da resveratrol preko specifičnih estrogenskih receptorskih mehanizmov učinkovito spodbuja sintezo in sproščanje NT-3 v astrocitih možganske skorje podgane. Resveratrol torej lahko preko spodbujanja nevrotrofične aktivnosti astrocitov pomembno pripomore k procesom sinaptične plastičnosti in ohranjanja funkcije osrednjega živčevja. Ključne besede: resveratrol, astrociti, nevrotrofin-3, estrogenski receptor V

8 ABSTRACT Resveratrol, a plant phytoestrogen, is a prospective therapeutic agent for prevention and treatment of neurodegenerative diseases. It passes blood-brain barrier, modulates nerve cells and importantly contributes to the astrocyte function. Neurotrophic factor neurotrophin-3 (NT-3) takes part in survival and differentiation of various nerve cell phenotypes, and contributes to synaptic plasticity. Astrocytes are important local source of NT-3, which synthesis is mediated by several factors. The influence of resveratrol on NT-3 synthesis is not known. Therefore in our work, we wanted to test the phytoestrogen's influence on astrocytic NT-3 synthesis and release. In our study we used primary cell cultures of rat cortical astrocytes. The cells were exposed to the influence of resveratrol, oestrogen receptor agonists and antagonists and several intracellular protein inhibitors. By specific enzyme immunoassay for quantitative NT-3 determination, we determined intracellular NT-3 content and release from astrocytes. Positive influence of resveratrol on NT-3 synthesis is fast but temporal, and dependent from incubation time and concentration of the substance. Most effective is at the 100 nm concentration, which causes a 3-fold increase in intracellular levels of NT-3 after 12-hour of incubation and 2.5-fold increase in NT-3 secretion 12 hours later, in comparison with control cells. With the oestrogen receptor agonists, 17ß-estradiol, PPT or DPN and antagonists ICI 182,780, MPP or PHTPP, we discovered that astrocytic NT-3 synthesis is both, ERα and ERβ, oestrogen receptor subtypes dependent process. Resveratrol causes intracellular Ca 2+ elevation and further PKC and CaMKII activation. It also activates PI3K and serin/threonin Akt kinasis and MAP kinase downstream cascade, which is the convergent point of the above mentioned protein cascades. Based on results obtained from our study we conclude that resveratrol effectively promotes synthesis and release of NT-3 in rat cortical astrocytes through specific oestrogen receptor mechanisms. Through astrocytic neurotrophic activity support resveratrol can significantly contribute to synaptic plasticity and central nervous system activity. Key words: resveratrol, astrocytes, neurotrophin-3, oestrogen receptor VI

9 SEZNAM OKRAJŠAV Akt serin/treonin protein kinaza (PKB) ANOVA analiza variance (analysis of variance) BDNF nevrotrofični dejavnik možganskega izvora BSA goveji serumski albumin CaMKII Ca/kalmodulin odvisna kinaza camp ciklični adenozin monofosfat DAG diacilglicerol dd H2O bidestilirana voda DMEM/F12 Dulbeccov modificiran Eaglov medij s Hamovo hranilno mešanico F-12 (1:1) DPBS Dulbeccova fiziološka raztopina z NaCl DPN agonist ERβ E2 17β-estradiol EDTA etilendiamin tetraocetna kislina ELISA encimsko imunska metoda (enzyme linked immuno sorbent assay) ERα estrogenski receptor α ERβ estrogenski receptor β FBS fetalni goveji serum GDNF nevrotrofični dejavnik glialnega izvora (glial cell derived neurotrophic factor) ICI 182,780 nespecifični antagonist estrogenskih receptorjev IP3 inozitol-3-fosfat MAP z mitogenom aktivirana protein kinaza MPP antagonist estrogenskega receptorja α NEM N-etilmalemid P/S penicilin-streptomicin p75 NTR nizkoafinitetni receptor za nevrotrofine PBS fosfatni pufer z NaCl PHTPP antagonist estrogenskega receptorja β PI3K fosfatidilinozitol-3-kinaza PIP3 fosfatidil inozitol-3-fosfat PKA protein kinaza A PKC protein kinaza C PMSF fenilmetil-sulfonil fluorid PPT agonist ERα RSV resveratrol VII

10 1 UVOD 1.1 Resveratrol Resveratrol (3,4,5'-trihidroksistilben) je naravni polifenol iz družine stilbenoidov, ki je pogovorno znan kot»zdravilo rdečega vina«. Prvi je ga iz korenin bele čmerike (Veratrum grandiflorum) izoliral in poimenoval dr. Michio Takaoka leta 1939 (1), leta 1963 pa so ga izolirali iz korenin japonskega dresnika (Polygonum cuspidatum, sinonim: Fallopia japonica), ki vsebuje ~0,1 mg resveratrola/g rastline in predstavlja poleg grozdnih jagod najbogatejši naravni vir te snovi (2). Resveratrol je prisoten v lupini in semenih več kot 70 različnih rastlinskih vrst, vključno z grozdjem, jagodičjem, žitaricami, stročnicami, čajem in arašidi (3). Zanimanje za resveratrol se je v strokovni in tudi laični javnosti razmaknilo leta 1992 s pojavom t.i.»francoskega paradoksa«. Termin je bil rezultat epidemioloških študij, ki so potrdile, da zmerno pitje rdečega vina, ki je med Francozi najpogosteje uživana alkoholna pijača, kljub kalorično bogati prehrani z visoko vsebnostjo nasičenih maščob, znižuje pojavnost srčno-žilnih obolenj (4). Kasnejše raziskave na živalskih modelih in v razmerah in vitro so razkrile številne zaščitne lastnosti resveratrola, saj naj bi zaradi protivnetnega, protivirusnega, antioksidativnega, antiproliferativnega in antiangiogenega delovanja preprečeval karcinogenezo, zmanjševal pogostost srčno-žilnih obolenj, sladkorne bolezni, nevrodegenerativnih stanj ter zaviral procese staranja (5,6). Klinične študije zaenkrat še niso potrdile terapevtskega potenciala resveratrola v tako velikem obsegu, vendar pa zaradi obetavne zaščitne vloge ostaja predmet zanimanja številnih raziskovalnih skupin (7) Biokemijske lastnosti resveratrola Resveratrol je fitoaleksin, ki ga rastline kot stranski produkt odziva na stres, uporabljajo za zaščito pred okužbami s patogenimi bakterijami in glivami (8). V grozdni lupini nastaja po fenilpropanoidni poti iz p-kumaroil CoA in malonil CoA v prisotnosti encima stilben sintaze (STS) kot obramba pred glivo Botrytis cinerea (9).Večja kot je okužba vinske trte, višja je tvorba polifenola. Stopnja okužbe je poleg vremenskih in klimatskih okoliščin odvisna še od številnih drugih dejavnikov (sestava tal, sorte grozdja). Resveratol je v velikih količinah prisoten v kožici grozdne jagode, v grozdnih pečkah, listih, pecljih in 1

11 vitičevju. Med proizvodnjo rdečega vina vse te sestavine med vrenjem anaerobno fermentirajo in resveratol se izloči v večji količini. Ker trdnih sestavin v procesu stiskanja grozdnega soka ne odstranijo takoj, je količina resveratrola v rdečem vinu okrog desetkrat višja kot v belem (10). Slika 1:Izomere resveratrola. Kemijska struktura cis- (A) in trans- (B) resveratrola. Molekula resveratrola je sestavljena iz dveh aromatskih obročev, ki sta povezana preko etilenskega mostu. V rastlinah je resveratrol prisoten v prosti in glikozilirani obliki v dveh geometrijskih izomerah s cis in trans konfiguracijo (Slika 1) (11,12). Trans-resveratrol je stabilen, farmakološko aktiven stereoizomer, ki v cis obliko prehaja pod vplivom toplote in UV svetlobe. Cis-resveratrol je občutljiv na atmosfersko oksidacijo in je stabilen le pri nevtralnem ph in ko je zaščiten pred svetlobo (13) Farmakokinetične lastnosti resveratrola Resveratrol je lipofilna molekula, ki se po peroralni aplikaciji hitro absorbira iz črevesja. Plazemska koncentracija doseže svoj vrh v minutah po zaužitju, vendar je zaradi presnove v enterocitih in obsežnega metabolizma prvega prehoda nizka. Pri peroralnem vnosu 25mg znaša le 1 5 ng/ml (14). Absorbira se 75% zaužitega resveratrola, pri čemer se v jetrih prek sistema citokromov P450 večina pretvori v glukuronidne in sulfatne konjugate (15). Prosti resveratrol se obsežno (>90%) veže na serumske lipoproteine, večinoma na albumin, kamor se v 50% vežejo tudi resveratrolni presnovki, ki se izločajo z urinom, del pa se preko enterohepatičnega obtoka dekonjugira in reabsorbira v telo (16). Resveratrol, ki se aplicira iz prehrambenih virov kot sta rdeče vino ali sok, se torej v plazmi pojavi z nizko biološko uporabnostjo v nanomolarnih koncentracijah (17). Z dvigom odmerka ali s ponavljajočim odmerjanjem se biološka uporabnost resveratrola značilno ne spremeni. 2

12 1.1.3 Spodbujanje biološke uporabnosti resveratrola Obetavna biološka aktivnostin terapevtska uporabnost resveratrola je razlog številnih raziskav, ki poskušajo izboljšati topnost in farmakokinetične lastnosti ter s tem povečati njegovo biološko uporabnost. Aplikacija z inhibitorji metabolizma (alkaloid piperin je skupaj z resveratrolom zavrl glukuronidacijo) (18), analogi resveratrola (v naravi prisoten dimetileterski derivat pterostilben je ob sočasni administraciji povečal plazemske nivoje in biološko uporabnost) (18) in dostavni sistemi na temelju nanotehnologij predstavljajo le nekaj poskusov izboljšanja biološke uporabnosti. Najbolj opogumljajoče rezultate dajejo inteligentni nosilci zdravil, kot so trdni lipidni nanodelci, liposomi in mikroemulzibilni sistemi. Pri kontrolirani dostavi se poveča topnost, stabilnost in varnost resveratrola ter tarčna specifičnost (18, 19). Pri zdravljenju Alzheimerjeve bolezni so za dostavo v možgane z namenom izboljšati distribucijo in omejiti metabolizem razvili nanokapsule z lipofilnim jedrom (angl. lipid-core nanocapsules) (20). Po enkratni/ponavljajoči peroralni in intraperitonealni aplikaciji so bile tkivne koncentracije višje kot prosti resveratrol (20), za gastrointestinalni trakt pa so bile ponavljajoče peroralne aplikacije tudi varnejše (20). Za dokončno potrditev povezave med izboljšanjem farmakokinetičnih lastnosti in večjo terapevtsko učinkovitostjo resveratrola,bodo potrebne še nadaljnje študije v razmerah in vivo. Pri povečanju biološke uporabnosti je potrebno pozorno spremljati toksičnost organskih topil in drugih ekscipientov, ki se uporabljajo v formulacijah. Ker resveratrol v odvisnosti od odmerka izzove terapevtski in pa tudi škodljiv, toksičen ali celo citotoksičen učinek, ga ne smemo obravnavati zgolj kot prehranski dodatek, temveč kot zdravilo. Pazljivost terja tudi hkratna aplikacija z drugimi zdravili, ki se podobno kot resveratrol presnavljajo prek sistema citokromov P450. Dolgotrajno zdravljenje z resveratrolom zaenkrat ni priporočljivo. Odmerki v obsegu od 100 mg do nekaj g/dan temeljijo na živalskih študijah, dolgotrajna uporaba visokiho dmerkov pa naj bi se, dokler ne bodo znani rezultati dolgotrajnih raziskav na ljudeh, uporabljala le eksperimentalno. Želja proizvajalcev po prodaji izdelkov s čimvišjo vsebnostjo resveratrola zaenkrat ni upravičena, saj naravno še ne pomeni varno (7, 21). 3

13 1.1.4 Farmakološki učinki resveratrola Številne raziskave na živalskih modelih in izsledki kliničnih študij nakazujejo zaščitno delovanje resveratrola in njegovo terapevtsko vlogo, saj naj bi s proženjem različnih biokemijskih mehanizmov zmanjševal pojavnost nekaterih kroničnih obolenj (Slika 3). Podatki iz literature kažejo, da resveratrol z ugodnim vplivom na vnetne, fibrinolitične in aterogene procese ščiti srčno-žilno funkcijo (6, 21). Z uravnavanjem metabolizma glukoze, akumulacije maščob, sproščanja in rezistence inzulina ter endotelijske funkcije preprečuje razvoj kroničnih bolezni energijske homeostaze kot sta metabolni sindrom in sladkorna bolezen tipa 2 (22). Slika 2: Zaščitno delovanje resveratrola. Resveratrol zavira procese, ki so povezani s sladkorno boleznijo tipa 2, srčno-žilnimi boleznimi in nevrodegenerativnimi obolenji. Veliko zanimanje raziskovalcev je usmerjeno v zaščitno in terapevtsko vlogo resveratrola pri različnih vrstah rakavih obolenj. Znano je, da preko modulacije celičnega cikla in indukcije apoptoze zavira karcinogenezo, z antiangiogenim delovanjem preprečuje metastaziranje rakavih celic, z zaviranjem sistema insulinu podobnih rastnih dejavnikov (IGF) pa preprečuje neoplastične transformacije zdravih celic (15, 23). Ugotovitve nedavnih študij kažejo, da resveratrol v kombinaciji z drugimi zdravili sinergistično ali aditivno povečuje učinkovitost zdravljenja ter hkrati zmanjšuje toksičnost in neželene učinke obstoječih terapij (24). 4

14 Zaradi učinkovitega antioksidativnega in protivnetnega delovanja predstavlja resveratrol obetavno terapevtsko sredstvoza preprečevanje in zdravljenje nevrodegenerativnih obolenj kot so Alzheimerjeva, Parkinsonova, Huntingtonova bolezen in cerebralna ishemija (25). Raziskave na živalskih modelih Alzheimerjeve bolezni so med drugim potrdile, da resveratrol preko zniževanja nivojev amiloidnih beta peptidov in spodbujanja cepitve transmembranskega β-amiloidnega prekurzorskega proteina (β-app) zavira tvorbo amiloidnih plakov, preprečuje aktivacijo mikroglije in zmanjšuje dovzetnost za oksidativne poškodbe živčnih celic in njihovo celično smrt (25). Kot spodbujevalec sinteze dušikovega oksida izboljšuje endotelijsko vazodilatorno funkcijo in s tem kognitivne procese v osrednjem živčevju (26). Resveratrol je zanimiv tudi zaradi sposobnosti zaviranja procesov, ki spremljajo staranje organizma. Prožil naj bi mehanizme, ki posnemajo biokemijske procese zmanjšanega vnosa kalorij in normalnega vnosa zadostne količine vitaminov, mineralov in drugih nujno potrebnih snovi (angl. caloric restriction, CR). Znano je, da CR pri sesalcih občutno upočasni staranje in nastanek kroničnih bolezni, ki so glavni vzrok smrti. Študije na glodalcih so pokazale, da resveratrol izboljšuje občutljivost na inzulin, motorično funkcijo in mitohondrijsko aktivnost ter ugodno vpliva na energijsko ravnotežje (27). Specifični biokemijski mehanizmi zaščitnega delovanja resveratrola še niso dokončno pojasnjeni, prav tako niso dovolj poznani možni učinki njegovih presnovkov in odmerki resveratrola za dosego pravega razmerja med koristnim in tveganim delovanjem. Klinične raziskave, ki bi dokončno razjasnile terapevtsko uporabnost te zdravilne učinkovine, so v teku (21), tiste, ki bi ugotavljale dolgotrajnejše učinke terapije z resveratrolom, pa na to še čakajo. 5

15 1.2 Astrociti Nemški patolog Rudolf Virchow je l prvi poimenoval nevroglijo in jo opisal kot homogeno populacijo nevzdražnih celic, ki skrbijo, da so živčne celice pravilno razporejene po živčevju, same pa ne prispevajo k višjim možganskim funkcijam (28). Več različnih oblik glije je na podlagi lastne barvne reakcije prepoznal Golgi, Ramon y Cajal pa je l prvič jasneje razločil med vlaknasto in protoplazmatsko glijo, obe ektodermalnega izvora. Rio Hortega je kasneje razdelil glijo na ektodermalno makroglio; oligodendrociti in astrociti ter mikroglijo mezodermalnega izvora, ki kot del imunskega sistema varuje možgane pred infekcijami in poškodbami (Slika 4) (29, 30, 31). Slika 3: Nevrovaskularna enota. Interakcije med glijo in živčnimi celicami osrednjega živčevja (prirejeno po 30). Danes je znano, da glijalne celice nimajo samo pasivne podporne vloge, ampak pomembno vplivajo na razvoj in normalno delovanje živčnih celic ter sodeljujejo pri adaptaciji živčevja na patološke procese. Podpirajo nevrotransmisijo, vzdržujejo ionsko ravnotežje v zunajceličnem prostoru in aktivno posegajo v delovanje možganov (30). Astrociti so bili že za časa Cajala razdeljeni v dva morfološka tipa, podolgovati protoplazmatski astrociti v sivi substanci z izraženim S100 beta proteinom in vlaknasti 6

16 astrociti v možganski belini s kratkimi in močno razvejanimi izrastki. Slednji izražajo, citoskeletno beljakovino GFAP (angl. glial fibrilar acid protein), ki služi kot njihov označevalec. Protoplazmatski astrociti so povezani s sinapsami, endotelijskimi celicami in telesi živčnih celic in tako predstavljajo pomemben sestavni del nevrovaskularne enote (32) Vloga astrocitov Astrociti se hitro odzivajo na spremembe v okolju in v različnih življenjskih obdobjih spreminjajo svojo obliko in funkcijo, aktivno posegajo v dogodke ob možganski poškodbi in regeneraciji ter predstavljajo enakovreden člen v tridelni sinapsi. Razvojno obdobje Med embrionalnim razvojem radialna glija (prve diferencirane celice glije) vodi in usmerja rastoče živčne celice, omogoča preživetje, diferenciacijo in zorenje živčnih celic ter usmerja rast aksonov s sintezo in sproščanjem nevrotrofičnih dejavnikov, sodeluje pri nastanku sinaps (30, 33). Odraslo obdobje V odraslem obdobju astrociti skrbijo za ustvarjanje primernega okolja za normalno delovanje živčevja: sodelujejo v presnovnih procesih: s svojimi izrastki povezujejo kapilare z živčnimi celicami in kot odgovor na povišano nevronsko aktivnost povečajo lokalni pretok krvi in oskrbijo aktivne možganske regije s kisikom in glukozo; iz krvnih žil privzemajo glukozo in jo pretvarjajo v glikogen; v odsotnosti glukoze presnavljajo glikogen in sproščajo laktat enakovreden presnovni substrat za živčne celice, ki ga uporabijo za sintezo celične energijske molekule ATP, skrbijo za homeostazo živčevja, saj s privzemanjem prebitka K +, amonijaka in živčnih prenašalcev ščitijo živčne celice pred ekscitacijsko poškodbo, sodelujejo v krvno-možganski pregradi: s sproščanjem različnih dejavnikov vplivajo na tvorbo tesnih stikov med endotelijskimi celicami, vplivajo na prepustnost membrane in encimsko aktivnost endotelijskih celic, 7

17 so enakovredni partner tridelne sinapse, izražajo številne receptorje za živčne prenašalce, preko katerih se lahko odzivajo na nevronsko aktivnost in modulirajo sinaptično aktivnost s sproščanjem glijalnih prenašalcev (glutamat, ATP, aspartat, taurin, nevropeptidi, eikozanoidi, steroidi in rastni dejavniki), vplivajo na nastajanje, zorenje, vzdrževanje in odstranjevanje sinaps, sodelujejo pri uravnavanju sinaptične plastičnosti, s pospeševanjem proliferacije in usmerjanjem matičnih živčnih celic v razvoj živčnih celic uravnavajo nevrogenezo, so lahko izvor novih živčnih celic v odraslem živčevju (30, 34, 35). Patološki procesi Virusne okužbe, mehanske poškodbe, degenerativni procesi in nekateri nevrotoksini povzročijo, da se mirujoči astrociti spremenijo v reaktivne celice, ki posredujejo pri procesu regeneracije ali brazgotinjenju, kadar pride do večje izgube živčnih celic. T. i. reaktivna astroglioza se razlikuje glede na naravo poškodbe in mikrookolja, kjer je do te poškodbe prišlo. Hipertrofija astrocitov: reaktivni astrociti so veliko večji kot astrociti v mirujoči fazi, poveča se izražanje strukturnih (GFAP, protein S100B, vimentin) in drugih molekul (receptorji, rastni dejavniki, encimi, regulatorji vnetja, regulatorji transkripcije, medceličnih in adhezijskih molekul); reaktivni astrociti tako pridobijo nekatere lastnosti astrocitov iz obdobja razvoja, pri hujših poškodbah pride do proliferacije astrocitov in nastanka brazgotin, ki lahko ščitijo nepoškodovano tkivo, hkrati pa omejujejo ponovno rast in delovanje aksonov, podpirajo preživetje in rast živčnih celic s povečano sintezo in sproščanjem nevrotrofičnih dejavnikov (33). 8

18 1.3 Nevrotrofini Nevrotrofini so družina strukturno sorodnih rastnih dejavnikov, ki živčnim celicam v osrednjem in perifernem živčevju nudijo trofično podporo s tem, da uravnavajo njihovo rast, preživetje in diferenciacijo, sodelujejo pa tudi pri sintezi in sproščanju živčnih prenašalcev, uravnavanju sinaptične plastičnosti in pri stabilizaciji sinaptičnih stikov. Nevrotrofini usmerjajo rast aksonov (tropično delovanje) in zagotavljajo zadostno gostoto mreženja med živčnimi celicami in tarčo. Med razvojem tarčna tkiva živčnih celic sproščajo nevrotrofične dejavnike v majhnih količinah in živčne celice zanje tekmujejo. Stabilna nevronska populacija se oblikuje, ko živčne celice, ki ne dobijo zadostne trofične podpore, propadejo v procesu programirane celične smrti (36). V petdesetih letih prejšnjega stoletja sta znanstvenika Rita Levi-Montalcini in Viktor Hamburger odkrila prvi nevrotrofični dejavnik, tj. živčni rastni dejavnik NGF (angl. nerve growth factor) (37), kasneje pa so odkrili še nevrotrofični dejavnik možganskega izvora BDNF (angl. brain-derived neurotrophic factor) (38, 39), nevrotrofin-3 NT-3 (angl. neurotrophin-3) (40, 41), nevrotrofin-4/5 (NT-4/5) (42, 43), pri ribah nevrotrofin-6 (NT-6) (44) in nevrotrofin-7 (NT-7) (45, 46). Klasična nevrotrofična hipoteza temelji na opazovanju učinka NGF na simpatične, senzorične in holinergične nevrone in je bila kasneje potrjena še pri drugih nevrotrofinih. Nevrotrofini, ki jih sproščajo tarčna tkiva, se vežejo na specifične receptorje na živčnih končičih presinaptičnih živčnih celic. Kompleks ligand-receptor se internalizira v celico in se z retrogradnim transportom prenese v telo živčne celice, kjer aktivira sekundarne prenašalce. Ti sprožijo transkripcijo različnih genov, ki uravnavajo preživetje in fenotip živčne celice (47, 48). Nevrotrofini v osrednjem živčevju delujejo tudi prek parakrinih (glijalne celice) in avtokrinih mehanizmov, ki poleg preživetja in ohranjanja fenotipa vplivajo tudi na sproščanje živčnih prenašalcev (47, 48). 9

19 1.3.1 Nevrotrofin-3 Nevrotrofin-3 je 119 aminokislin dolg protein, katerega aminokislinsko zaporedje je identično pri podganah, miših in človeku. Poleg NGF in BDNF spada v gensko družino nevrotrofinov, katere značilnost je evolucijsko ohranjena regija šestih cisteinskih ostankov, povezanih v pare s tremi disulfidnimi mostički (40, 41) Receptorji za NT-3 Nevrotrofini sprožijo celične učinke prek vezave na Trk receptorje z lastno tirozin kinazno aktivnostjo in prek vezave na receptor p75 NTR, ki spada v družino receptorjev za dejavnik tumorske nekroze. NT-3 se prednostno veže na TrkC receptor (Slika 5), edini med nevrotrofini pa se veže še na TrkA in TrkB receptor. Na receptor p75 NTR se veže z enako afiniteto kot ostali nevrotrofini (BDNF, NGF, NT4/5). Na specifičnost odgovora živčne celice, ki ga sprožijo nevrotrofini, vpliva tudi alternativno izrezovanje eksonov za zunajcelično domeno receptorjev Trk in nivo izražanja receptorja p75. Sposobnost NT-3, da aktivira TrkA in TrkB, je zmanjšana v primeru izražanja visokih nivojev receptorja p75 (49, 50). 10

20 Vezava na TrkC receptor sproži dimerizacijo receptorja in avtofosforilacijo tirozinskih ostankov, ki predstavljajo sidriščna mesta za encime, PLC-γ1, in adaptorske proteine. Glavne signalne poti, ki jih sproži aktivacija TrkC receptorja so: - Ras/MAP kinazna pot - PI-3K/Akt signalna kaskada - PLC-γ1/mobilizacija Ca 2+ ionov in aktivacija PKC (51, 52). Slika 4: Vezava NT-3 na TrkC receptor in aktivacija znotrajceličnih signalnih poti. Aktivacija receptorja p75 NTR brez prisotnosti receptorjev Trk sproži različne znotrajcelične signalne poti: aktivira transkripcijski dejavnik jedrni faktor κb (NF-κB) (53), v nekaterih celičnih tipih zveča fosforilacijo Akt, aktivira JNK (c-jun N-terminalna kinaza) signalno pot in povzroči hidrolizo sfingomielina do ceramida, ki lahko preko aktivacije kaspazne poti povzroči apoptozo živčnih celic (54). Prisotnost receptorja p75 lahko vpliva na vezavo nevrotrofinov na receptorje Trk; pride do povečanega števila vezavnih mest, povečane vezavne kapacitete in povečane selektivnosti vezave na receptorje Trk. Ob sočasni aktivaciji receptorja Trk pride do inhibicije proapoptotskih signalnih poti, ki jih sicer proži aktivacija receptorja p75. Receptor p75 naj bi bil kot proapoptotski receptor še posebno pomemben med razvojem. Nevrotrofin, ki ne 11

21 aktivira uspešno receptorja Trk, z vezavo na receptor p75 povzroči apoptozo celic in tako skrbi za pravilno tarčno oživčenost (55) Razporeditev NT-3 in TrkC NT-3 je v nezrelih regijah osrednjega živčevja med vsemi nevrotrofini najbolj izražen, z zorenjem teh regij pa se nivoji znižajo in v odraslem živčevju zaznamo le manjše količine NT-3. NT-3 mrna so najprej zasledili v živčnih celicah hipokampusa glodalcev (56), z nadaljnimi raziskavami pa so njegovo prisotnost potrdili v živčnih celicah in astrocitih možganske skorje, malih možganov, vohalnih betičev, septuma, možganskega debla in hrbtenjače, pa tudi v oligodendrocitih v beli substanci hrbtenjače in kortikalni mikrogliji. Izražanje TrkC sovpada z zgodnjim izražanjem NT-3 in je, podobno kot NT-3, izražen v večini možganskih regij. TrkC mrna so v obliki popolnega in okrnjenega receptorja zasledili v celičnih kulturah astrocitov in oligodendrocitov (57). V veliko višjih koncentracijah kot v osrednjem živčevju se NT-3 nahaja v perifernih tkivih. Zasledili so ga v priželjcu, žlezi slinavki, brbončicah, lasnih foliklih, srcu, trebušni preponi, jetrih, ledvicah, nadledvični žlezi, trebušni slinavki, črevesju, jetrih, vranici, jajčnikih in testisih, keratinocitih, monocitih in limfocitih (58) Vloga NT-3 Leta 1990 je Maisonpierre s sodelavci v eksplantatu dorzalnih ganglijev opazil obsežen razrast izrastkov senzoričnih nevronov in tako prvič orisal trofično aktivnosti NT-3 (40). Kasneje so z raziskavami na celičnih kulturah potrdili vpliv na preživetje noradrenergičnih, glutamatnih, GABA-nergičnih, dopaminskih in holinergičnih, serotoninskih nevronov in internevronov hrbtenjače, razrast izrastkov živčnih celic, proliferacijo in diferenciacijo nevronskih prekurzorskih celic v nevrone ter tako nakazali vlogo pri procesih učenja in spomina. NT-3 sodeluje pri formaciji talamokortikalnega trakta, saj iz kortikalnih nevronov usmerja holinergične nevrone prednjih možganov do njihovih tarč v možganski skorji (59, 60). 12

22 Poleg klasične nevrotrofične vloge imajo nevrotrofini tudi modulatorne učinke na sinaptični prenos. NT-3 vpliva na funkcionalno in strukturno plastičnost preko dveh različnih znotrajceličnih poti: 1. Inducira nastanek ekscitatornih sinaps in vpliva na ekscitatorno ter tudi inhibitorno sinaptično aktivnost; 2. Dolgotrajna izpostavljenost močno poveča število presinaptičnih varikoz v živčnomišičnem stiku ter strukturno in funkcionalno podpira sinapse živčno-mišičnega stika (61). Zaradi širokega spektra nevrotrofičnega delovanja na različne populacije živčnih celic se je kmalu po odkritju vloge nevrotrofinov začelo raziskovanje njihove vpletenosti v različne nevrodegenerativne bolezni in možnosti njihove terapevtske uporabe pri različnih obolenjih in poškodbah živčevja. Spremenjene nivoje NT-3 so opazili pri številnih patoloških stanjih vključno s shizofrenijo (62), depresijo (63), Parkinsonovo bolezenijo (64), epilepsijo (65), multiplo sklerozo (66) in stresom (67). Ker nevrotrofini slabo prehajajo krvno-možgansko pregrado, je zdravljenje z njimi precej omejeno. Največ uspehov so dosegli pri transplantaciji gensko spremenjenih celic (matične celice kostnega mozga, živčne matične celice), ki sproščajo povečane količine NT-3 (68). Tako lahko nevrotrofini obdržijo ali celo ojačajo obstoječe sinapse in zakasnijo ali celo preprečijo celično smrt. Po drugi strani pa lahko prevelike količine rastnih dejavnikov motijo normalno funkcijo celic oz. sinaps. Zato mora biti dostava učinkovita, varna in ciljna; le na tiste predele, kjer se nahajajo funkcionalno okrnjene celice, sicer lahko s stimulacijo netarčnih celic povzročijo preveč škodljivih stranskih učinkov. 13

23 1.3.5 Uravnavanje sinteze NT-3 Poglavitni vir NT-3 v osrednjem živčevju predstavljajo živčne celice, kjer njegovo sintezo uravnavajo različni dejavniki iz okolja. Na raven NT-3 vplivajo nevronska aktivnost živčnih celic (69), hormonsko ravnotežje (70, 71), nevrotrofini (72, 73) in številne farmakološko aktivne snovi. Znano je, da dvig izražanja NT-3 v možganih glodalcev med drugim spodbujajo MDMA (3,4-metillenedioksimetamfetamin) (74), morfij (75) nikotin (76), zavirajo pa antiepileptična zdravila (77) in kronična terapija z antidepresivi (78). Poleg živčnih celic NT-3 nastaja tudi v astrocitih, ki predstavljajo pomemben lokalni vir nevrotrofinov (57, 79, 80). Dejavniki, ki uravnavjo sintezo NT-3 v astrocitih, so slabo poznani, raziskave na celičnih kulturah astrocitov glodalcev pa so potrdile spodbudni vpliv živčnih prenašalcev (80, 81), endotelinskega sistema (82), interlevkina-6 (83), deksametazona (84) in kortikosterona (85). Vpliv resveratrola na sintezo NT-3 ni poznan. 14

24 1.4 Resveratrol in astrociti Resveratrol prehaja krvno-možgansko pregrado in s svojim delovanjem ščiti funkcijo možganskih celic. Zaradi aktivne vloge pri uravnavanju delovanja živčnih celic predstavljajo astrociti pomembno tarčno mesto za resveratrol. Raziskave na astrocitih v celični kulturi so pokazale, da je resveratrol učinkovit modulator njihove funkcije. Sodeljuje pri metabolizmu živčnega prenašalca glutamata, kjer spodbuja aktivnost glutamatnih transporterjev in encimsko aktivnost glutamin sintetaze (GS) ter inducira hiter porast tripeptida glutationa (GSH), poglavitnega antioksidanta v možganih (86). Študija na hipokampalnih astrocitih odraslih in ostarelih podgan je pokazala, da resveratrol tudi v teh celicah spodbuja aktivnosti GS in nivoje GSH ter zavira sproščanje mediatorjev vnetja TNF-α in IL-1β, kar nakazuje njegovo antioksidativno in zaščitno vlogo tudi v starejših možganih (87). Resveratrol uravnava nevrotrofično aktivnost astrocitov, saj spodbuja sproščanje BDNF in glijalnega nevrotrofičnega dejavnika GDNF (angl. glial cell linederived neurotrophic factor) (88) in s tem trofično podpira dopaminske živčne celice v kulturi (89). V ekscitotoksičnih pogojih resveratrol povečuje sproščanje nevrotrofičnega dejavnika S100B, vezavnega proteina za Ca 2+, zavira pa mediatorje vnetja kot so TNF-α, IL-1β, IL-6, dušikov oksid (NO) in transkripcijski dejavnik NF-κB (90, 91). Po možganski poškodbi zmanjšuje pojavnost apoptoze in avtofagije astrocitov, saj zavira poškodbo mitohondrijev in z glutamatom in reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) posredovano aktivacijo glikogen sintazne kinaze-3ß (GSK-3ß), encima, ki ima ključno vlogo pri odločanju o preživetju in celični smrti poškodovanih celic (92). Preko inhibicije Ca 2+ kanalov zavira sproščanje gliotransmiterjev glutamata in D-serina ter fosforilacijo p38 MAP kinaze, tj. s stresom aktivirane kinaze, ki prispeva k nevrotoksični celični smrti po možganski poškodbi (93). 15

25 2 NAMEN DELA Astrociti so celice glije, ki metabolno in trofično podpirajo živčne celice, modulirajo sinaptično aktivnost ter aktivno posegajo v dogodke ob možganskih poškodbah in nevrodegenerativnih obolenjih. Predstavljajo pomemben lokalni vir NT-3, nevrotrofičnega dejavnika s širokim spektrom delovanja v osrednjem živčevju. Njegovo sintezo v astrocitih uravnavajo številne farmakološko aktivne snovi. Vpliv resveratrola, naravnega neflavonoidnega polifenola z znanim zaščitnim delovanjem v možganih, na sintezo NT-3 ni poznan. V diplomskem delu bomo preverili naslednje delovne hipoteze: 1. Resveratrol spodbuja sintezo NT-3 v astrocitih podgane. Resveratrol ugodno vpliva na procese, ki potekajo v astrocitih. Proučili bomo spodbudni vpliv resveratrola na znotrajcelično vsebnost in sproščanje NT-3 v astrocitih in določili koncentracijsko in časovno odvisnost sinteze NT-3 v prisotnosti te snovi. 2. Resveratrol spodbuja sintezo NT-3 preko aktivacije estrogenskih receptorjev. Resveratrol posreduje svoje učinke preko mnogih tarčnih mehanizmov, med drugim tudi preko vezave na estrogenske receptorje (94). Astrociti izražajo oba podtipa membranskega estrogenskega receptorja, tip (ER ) in tip β (ERβ) (95). Z uporabo selektivnih ligandov bomo proučili možnost aktivne vloge estrogenskih receptorjev ER in ERβ pri spodbudnem vplivu resveratrola na povečanje znotrajcelične vsebnosti NT-3 v astrocitih. 3. Resveratrol spodbuja sintezo NT-3 preko različnihih znotrajceličnih signalnih poti. Sinteza NT-3 v astrocitih poteka preko aktivacije različnih znotrajceličnih signalnih poti kot so camp/pka, dvig znotrajceličnega Ca 2+ in aktivacija PKC ali MAP kinazna pot (80, 81) ter nekatere druge. S pomočjo specifičnih inhibitorjev encimov, ki so udeleženi pri posamezni znotrajcelični signalni kaskadi, bomo preverili, preko katerih mehanizmov resveratrol spodbuja astrocitno sintezo NT-3. 16

26 3 MATERIALI IN METODE 3.1 Materiali Za pripravo celičnih kultur L-15: Leibowitzev medij (Gibco, Life Technologies, Carlsbad) DMEM/F12: Dulbeccov modificiran Eaglov medij s Hamovo hranilno mešanico F-12 v razmerju 1:1 (Gibco, Life Technologies, Carlsbad) FBS: Fetalni goveji serum (Gibco, Life Technologies, Carlsbad) P/S: Penicilin-streptomicin (10.000IU/ml UG/ml) PBS: Fosfatni pufer z NaCl ph=7,4 (10x) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad) DPBS: Dulbeccov fosfatni pufer z NaCl (10x) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad) 2,5 % Tripsin (10x) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad) NaHCO 3 : Natrijev bikarbonat za celične kulture (Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA) Steklenice in petrijevke za gojenje celičnih kultur (NUNC, Rosklide, Danska) Spojine za tretiranje celičnih kultur resveratrol (Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA) H-89 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA) staurosporin (Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA) KN-62 (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) PD98059 (Promega, Madison, ZDA) wortmanin (Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA) ICI 182,780 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA) MPP: 1,3-bis(4-hidroksifenil)-4-metil-5 -[4-(2-piperidiniletoksi)fenol]-1H-pirazol (Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA) PHTPP: 4-[2-fenil-5,7-bis(trifluorometil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]fenol (R&D Systems, Minneapolis, ZDA) 17ß-estradiol PPT: 4,4',4''-(4-Propyl-[1H]-pyrazole-1,3,5-triyl)trisphenol (R&D Systems, Minneapolis, ZDA) DPN: 2,3-bis(4-Hydroxyphenyl)-propionitrile (R&D Systems, Minneapolis, ZDA) 17

27 Uporabljali smo tudi druge kemikalije proizvajalcev Sigma-Aldrich (ZDA) in Merck KgaA (Nemčija) Za encimsko-imunsko metodo monoklonalno mišje protitelo proti človeškemu NT-3 z biotinom označeno kozje protitelo proti človeškemu NT-3 rekombinantni človeški NT-3 (rhnt-3) streptavidin, konjugiran s hrenovo peroksidazo stabiliziran hidrogen peroksid (barvni reagent A) stabiliziran tetra-metilbenzidin (barvni reagent B) (vse R&D Systems, Minneapolis, ZDA) H 2 SO 4 (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) goveji serumski albumin (BSA), saharoza, natrijev azid (NaN 3 ), Triton X-100, Trizma baza, natrijev klorid (NaCl), fenilmetil-sulfonil florid (PMSF), N-etilmalaemid (NEM), kalcijev klorid (CaCl2), EDTA (vse Sigma-Aldrich, St. Louis, ZDA) Tween 20 (Promega Corporation, ZDA) plošče za encimsko-imunske poskuse (NUNC, Roskilde, Danska) BIO-RAD komplet za določevanje proteinov (Bio-Rad Laboratories, München, Nemčija) Poskusne živali Za pripravo in izolacijo celičnih kultur astrocitov smo uporabili možgansko skorjo novorojene podgane. Živali so bile stare ne več kot tri dni in vzgojene v Medicinskem eksperimentalnem centru Inštituta za patologijo Medicinske fakultete v Ljubljani. Usmrtitev živali smo priglasili na Veterinarsko upravo Republike Slovenije (potrdilo št /2008/3) 18

28 3.2 Metode Gojišča in pufri Za 500 ml DMEM medija: 6 g DMEM/F-12 1,219 g NaHCO ml ddh 2 O Za 120 ml inkubacijskega medija: 106,8 ml DMEM medija 12 ml FBS 1,2 ml DPBS Za 160 ml DPBS/EDTA: 16 ml 10x EDTA 144 ml DPBS Za 100 ml 10x EDTA (10mM): 0,372 g EDTA 100 ml DPBS/EDTA Za 40 ml 0,25% raztopine tripsina: 4 ml 2,5 % tripsina 36 ml DPBS/EDTA 19

29 3.2.2 Priprava astrocitov Primarne celične kulture smo pripravili po metodi, opisani v Mele s sodelavci (2010) (80). Novorojene (2 3 dni stare) podgane smo evtanazirali z dekapitacijo in jim odvzeli možgane v aseptičnih pogojih. Po odstranitvi možganskih ovojnic smo skorjo ločili od preostalih možganov in skozi sterilno najlonsko mrežico (premer por 75 m) tkivo mehansko razdružili v inkubacijski medij. Celice smo v 75 cm 2 steklenicah za celične kulture gojili do stanja ~70 80 % konfluentnosti v vlažni atmosferi s 5 % CO 2 in 90 % zraka pri konstantni temperaturi 37 C z rednim menjavanjem medija in stalnem spremljanju rasti pod mikroskopom. Po treh ciklih stresanja čez noč na 200 obratih/min smo celice s pomočjo 0,25 % raztopine tripsina presadili v nove steklenice za gojenje celičnih kultur ter jih v enakih razmerah gojili do konfluentnosti (10 14 dni). Celice smo nato presadili na petrijevke (10 ml/petrijevko, Ø = 100 mm) ter jih pod zgoraj opisanimi pogoji gojili do stanja konfluentnosti (7 10 dni) z rednim menjavanjem medija na približno 3 dni ob stalnem spremljanju rasti celičnih kultur pod mikroskopom Tretiranje primarnih celičnih kultur Po končani rasti smo celice inkubirali v svežem mediju brez seruma z dodatkom vehikla H 2 O ali EDTA (za določitev bazalnih nivojev NT-3) ali z dodatkom resveratrola oziroma različnih ligandov estrogenskih receptorjev ali znotrajceličnih mediatorjev (V = 50 l). Glede na zahteve poskusa smo po zamenjavi medija in dodatku preiskovanih snovi celice inkubirali različno dolgo časa (3 48 h). Tretiranja astrocitov smo izvedli v naslednjih sklopih: 1. Določitev koncentracijske in časovne odvisnosti sinteze in sproščanja NT-3 proteina v astrocitih pod vplivom resveratrola Za natančno določitev spodbudnega vpliva resveratrola smo konfluentne kulture astrocitov možganske skorje inkubirali v prisotnosti različnih koncentracij resveratrola (1 nm, 100 nm in 50 M) ali z dodatkom vehikla (H 2 O kontrolne celice). Celice smo v prisotnosti resveratrola inkubirali od 3 do 48 ur. 20

30 2. Določitev receptorskih mehanizmov, preko katerih resveratrol povišuje sintezo NT-3 v astrocitih Za določitev receptorjev, preko katerih resveratrol spodbuja sintezo NT-3, smo celične kulture 12 ur inkubirali s 100 nm resveratrolom ob prisotnosti različnih koncentracij (1 pm 1 µm) ICI 182,780 (neselektivni antagonist estrogenskih receptorjev), MPP (selektivni antagonist ER ) ali PHTPP (selektivni antagonist ERβ). Celice smo za 12 ur izpostavili tudi neselektivnemu agonistu 17ß-estradiolu (E 2 ) (10 nm) in selektivnima agonistoma PPT (selektivni agonist ER ) in DPN (selektivni agonist ERβ) (10 nm). 3. Določitev znotrajceličnih poti, preko katerih resveratrol spodbuja sintezo NT-3 proteina v astrocitih novorojenih podgan Celične kulture smo 12 ur inkubiraliz 1 M H-89 (inhibitor PKA), 10 nm staurosporinom (inhibitor PKC), 10 M KN-62 (inhibitor CaMK II) in wortmaninom (inhibitor PI3K)v prisotnosti ali odsotnosti 100 nm resveratrola. V nadaljevanju smo celice za 1 uro izpostavili 20 M PD98059 (inhibitor MAP kinaze kinaze 1) in jih nato 12 ur inkubirali v prisotnosti ali odsotnosti 100 nm resveratrola. Po končani inkubaciji smo odpipetirali medij, celice sprali s 5 ml ledeno mrzlega PBS, jih postrgali ter celično suspenzijo centrifugirali 7 min pri obr./min pri temperaturi 4 C. Supernatant smo odlili, usedlino celic in celični medij pa smo do nadaljnjih poskusov shranili pri 70 C. 21

31 3.2.4 Priprava vzorcev za encimsko-imunske poskuse Reagenti: Puferna raztopina X: 50 mm Tris-HCl (ph 7,0) 200 mm NaCl 10 mm CaCl 2 0,1 % Triton X-100 0,5 % NaN 3 Puferna raztopina Y: 50 mm Tris-HCl (ph 7,0) 200 mm NaCl 10 mm CaCl 2 0,1 % Triton X-100 0,5 % NaN 3 10 % BSA v ddh 2 O Inhibitorji proteaz, dodani tik pred uporabo: 1mM EDTA, 1mM NEM in 1mM PMSF Celice v celični usedlini smo odtalili in jim dodali 1 ml puferne raztopine X. V desetih sekundah smo celice razbili z ultrazvočnim razbijalcem z močjo približno 1,5 Watta. Za določitev celokupnih celičnih proteinov smo vzorce (6 8 μl) odpipetirali na mikrotitersko ploščo. Vzorcem razbitih celic smo dodali 10 % puferne raztopine Y. Sledilo je 30 minutno centrifugiranje pri obr./min in 4 ºC. Supernatant smo shranili do izvedbe poskusov na 70 ºC. 22

32 3.2.5 Določitev celokupnih proteinov v vzorcih Za vsak vzorec za NT-3 ELISO smo v vzorcih (6 8 μl) homogenatov ultrazvočno razbitih celic določili količino celokupnih proteinov, da smo vsebnost celičnega NT-3 proteina lahko izrazili v pg NT-3/mg proteina. Na mikrotiterski plošči smo z metodo po Bradfordu (96) celokupne celične proteine določili s kompletom BIO-RAD spektrofotometrično. Za umeritveno krivuljo smo uporabili goveji serumski albumin v koncentraciji 0 50 μg/ml. Absorbanco vzorcev in standardov smo merili pri valovni dolžini 595 nm s čitalcem za mikrotitrske plošče SynergyHT, Bio Tek, Winooski, ZDA. Koncentracijo proteinov smo izračunali iz umeritvene krivulje, ki smo jo napravili na vsaki mikrotiterski plošči posebej Encimsko-imunska metoda za kvantitativno določanje NT-3 Za določitev celične vsebnosti NT-3 proteina v astrocitih podgane smo uporabili specifično dvostransko (sendvič) encimsko-imunsko metodo (NT-3 ELISA), ki smo jo razvili in optimizirali v našem laboratoriju (80). Reagenti: Puferna raztopina A: 50 mm Tris-HCl 200 mm NaCl 10 mm CaCl 2 0,1 % Triton X-100 0,5 % NaN 3 1 % BSA v ddh 2 O Puferna raztopina B: 0,05 % Tween 20 v PBS Puferna raztopina C: 1 % BSA 5 % saharoze 0,05 % NaN 3 v PBS 23

33 Puferna raztopina D: 0,1 % BSA 0,02 % NaN 3 0,05 % Tween 20 v PBS Puferna raztopina E: 1 % BSA v PBS Priprava standardov za umeritvene krivulje: Za vsak ELISA test smo na vsaki posamezni mikrotiterski plošči izdelali umeritveno krivuljo za določitev ravni NT-3 proteina. Za standard smo uporabili rhnt-3, ki smo ga ustrezno redčili (0 375 pg/ml) v puferni raztopini A. Ustrezne redčitve standardov smo hkrati z vzorci vnesli na mikrotitersko ploščo. Protokol NT-3 ELISA: 1) na ploščo za encimsko-imunski test (96 luknjic) smo nanesli 100 µl/luknjico primarnega monoklonskega protitelesa proti NT-3 proteinu (1 µg/ml v PBS) in inkubirali čez noč pri 4 ºC; 2) ploščo smo trikrat sprali s puferno raztopino B; 3) za preprečitev nespecifične vezave smo nanesli 300 µl/luknjico puferne raztopine C in čez 1 uro ploščo trikrat sprali s puferno raztopino B; 4) v luknjice smo v dveh paralelkah nanesli po 100 µl standarda (0 375 rhnt) oziroma vzorca in inkubirali 1,5 ure pri 37 ºC; 5) po petkratnem spiranju s puferno raztopino B, smo na ploščo nanesli 100 µl/luknjico z biotinom označenega sekundarnega protitelesa proti NT-3 proteinu (200 ng/ml v puferni raztopini D) in inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi; 6) ploščo smo petkrat sprali s puferno raztopino B in za 20 min dodali 100 µl/luknjico streptavidina, konjugiranega s hrenovo peroksidazo (1,25 mg/ml v puferni raztopini E); 7) po trikratnem spiranju s puferno raztopino B smo dodali substrat (1:1 mešanica stabiliziranega peroksida in kromogena) in po min ustavili encimsko reakcijo z dodatkom 50 µl H 2 SO 4 8) absorbanco obarvanega produkta smo merili spektrofotometrično v roku 15 min pri 450 nm s korekcijo pri 540 nm s čitalcem za mikrotiterske plošče (SynergyHT, BioTek, Winooski ZDA) 9) koncentracijo NT-3 proteina smo izračunali iz umeritvene krivulje. 24

34 Med seboj smo primerjali koncentracijo NT-3 proteina/mg celokupnih celičnih proteinov v kontrolnih in tretiranih celicah Statistična obdelava podatkov Vse poskuse smo ponovili vsaj trikrat v treh do petih paralelkah. Rezultate smo obdelali s pomočjo računalniškega programa GraphPad Prism za okolje Windows (GraphPad Software, San Diego, ZDA), predstavili pa smo jih s srednjo vrednostjo in standardno napako (x ± SEM). Statistično značilnost smo preverili z analizo variance (ANOVA) z Bonferronijevim post hoc testom. Za mejo statistične značilnosti smo vzeli vrednost p<

35 vsebnost NT-3 (pg NT-3/mg prot.) 4 REZULTATI 4.1 Koncentracijska in časovna odvisnost sinteze NT-3 v astrocitih pod vplivom resveratrola Spodbudni vpliv resveratrola na sintezo in sproščanje NT-3 v astrocitih je odvisen od koncentracije in časa inkubacije celic v prisotnosti te snovi (Slika 5 in 6). Astrocite možganske skorje podgane smo inkubirali v prisotnosti različnih (1 nm, 100 nm in 50 M) koncentracij resveratrola in znotrajcelično vsebnost NT-3 izmerili v različnih časovnih intervalih, od 3 ur do 48 ur. Ugotovili smo, da je vpliv resveratrola na celično vsebnost NT-3 hiter in prehoden. Značilni učinek smo opazili že po 6 urah inkubacije s 100 nm resveratrolom, ki je povzročil skoraj 2-kraten porast NT-3 v celicah, največji učinek pa smo določili po 12 urah izpostavljenosti vsem trem uporabljenim koncentracijam. Najučinkovitejši je bil 100 nm resveratrol, ki je povzročil 3-kratno povišanje bazalnih vrednosti NT-3 (34,2 1,7 pg NT-3/mg proteina) (Slika 5) ** *** *** *** *** *** *** *** kontrola 1 nm RSV 100 nm RSV 50 M RSV h 6h 12h 24h 36h 48h Slika 5: Vpliv različnih koncentracij resveratrola (RSV) (1nM, 100nM, 50µM) na časovno odvisnost celične vsebnosti NT-3 v primarnih kulturah astrocitov podgane. Vsebnost NT-3 proteina smo določili z NT-3 ELISO. Vrednosti so predstavljenje kot srednja vrednost SEM treh do petih neodvisnih poskusov. Statistično značilnost smo preverili z enosmerno analizo variance (one-way ANOVA) z Bonferronijevim post hoc testom in je označena kot ***p<0.001 in **p<0.01 v primerjavi s kontrolnimi celicami. 26