UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO MONIKA FABJAN (KRŢAN)

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO MONIKA FABJAN (KRŢAN) PRIMERJAVA UPORABNOSTI PREISKAV NA NATRIURETIČNI PEPTID IN PRO-NATRIURETIČNI PEPTID V SKUPINI KARDIOLOŠKIH BOLNIKOV THE COMPARISON OF ANALYSIS ON THE USEFULLNESS IN NATRIURETIC PEPTIDE AND PRO- NATRIURETIC PEPTIDE IN A GROUP OF CARDIO PATIENTS DIPLOMSKA NALOGA Ljubljana, 2009

2 Diplomsko delo sem opravljala v Diagnostičnem laboratoriju Splošne bolnišnice Novo mesto. Zahvala Zahvaljujem se mentorju izr. prof. dr. Borutu Boţič, mag. farm., spec. med. biokem. za njegovo usmerjanje in ideje pri pripravi ter oblikovanju diplomskega dela. Hvala. Natančnost, napotki in umirjenost somentorice asis. mag. Danijele Furlan, spec. med. biokem., ki mi je bila v uteho v mojih najbolj raztresenih trenutkih. Hvala. Za pomoč pri zbiranju podatkov se zahvaljujem vsem zaposlenim v Diagnostičnem laboratoriju Splošne bolnišnice Novo mesto. Hvala. Srčno se zahvaljujem mojemu moţu in staršem, ki me podpirajo in vzpodbujajo pri študiju. Hvala. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelala pod mentorstvom izr. prof. dr. Boruta Boţič, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorice asis. mag. Danijele Furlan, spec. med. biokem. Ljubljana, 2009 Monika Fabjan Predsednica diplomske komisije: izr. prof. dr. Janja Marc, mag. farm., spec. med. biokem. Članica diplomske komisije: prof.dr. Jana Lukač Bajalo, spec. med. biokem.

3 KAZALO VSEBINE POVZETEK... i ABSTRACT... ii SEZNAM OKRAJŠAV... iii 1. UVOD ZGRADBA IN DELOVANJE SRCA RAZVOJ BOLEZNI SRCA IN ŢILJA Srčno popuščanje Akutno srčno popuščanje (ACF) Kronično srčno popuščanje (CHF) DIAGNOSTIČNE METODE AKUTNEGA IN KRONIČNEGA SRČNEGA POPUŠČANJA Laboratorijske preiskave srčnega popuščanja Druge preiskave SRČNI OZNAČEVALCI PRI KARDIOLOŠKIH BOLNIKIH Natriuretični peptidi Moţganski natriuretični peptid (BNP) Princip metode merjenja BNP Natriuretični pro-peptid (pro-bnp) Princip metode merjenja pro-bnp NAMEN MATERIALI IN METODE PREISKOVANCI ZBIRANJE IN PRIPRAVA VZORCEV KONTROLA KAKOVOSTI METODE Merjenje koncentracije B-tip natriuretičnega peptida (BNP) Merjenje koncentracije natriuretičnega pro-peptida (pro-bnp) STATISTIČNO VREDNOTENJE REZULTATI IN RAZPRAVA... 20

4 4.1. REZULTATI MERITEV KONCENTRACIJ pro-bnp in BNP Rezultati analiz ob upoštevanju napovednih vrednosti pro-bnp za CHF Rezultati analiz ob upoštevanju napovednih vrednosti BNP za CHF Korelacija obeh označevalcev IZKLJUČITVENE VREDNOSTI (praţne) pro-bnp IN BNP ZA CHF Izključitvene vrednosti pro-bnp za CHF Izključitvene vrednosti BNP za CHF REZULTATI SKUPINE BOLNIKOV S SUMOM NA KRONIČNO SRČNO POPUŠČANJE (CHF) (A) Korelacijska analiza obeh označevalcev REZULTATI POSEBNE SKUPINE BOLNIKOV Z AKUTNO LEDVIČNO ODPOVEDJO (B) Korelacijska analiza obeh označevalcev ZAKLJUČEK SKLEPI LITERATURA KAZALO SLIK Slika 1: Vzdolţni prerez srca z osnovno zgradbo srca.1 Slika 2: Napredovanje srčnega popuščanja.3 Slika 3: Biološko aktivni hormon BNP Slika 4: Princip metode CMIA..10 Slika 5: prohormon pro-bnp (108 ak)..11 Slika 6: Sinteza BNP in NT-proBNP 12 Slika 7: Grafični prikaz bolnikov po skupinah in spolu 15 Slika 8: Princip metode sendvič tehnike 18 Slika 9: Grafična porazdelitev celotne skupine bolnikovih vzorcev glede na izmerjene koncentracije pro-bnp z upoštevanjem starosti...21 Slika 10: Grafični prikaz porazdelitve celotne skupine bolnikovih vzorcev v kategorije glede na izmerjene koncentracije BNP..23 Slika 11: Grafični prikaz rezultatov bioloških vzorcev bolnikov z izključitveno vrednostjo pro-bnp za CHF...25 Slika 12: Grafični prikaz rezultatov bioloških vzorcev skupine bolnikov z izključitveno vrednostjo BNP za CHF...26 Slika 13: Grafični prikaz izmerjenih koncentracij pro-bnp in BNP bolnikov s sumom na kronično ishemično bolezen....28

5 Slika 14: Grafični prikaz izbrane skupine bioloških vzorcev bolnikov glede na koncentracije pro-bnp in BNP..31 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica I: Najpomembnejši vzroki za nastanek akutnega srčnega popuščanja... 4 Preglednica II: Orientacijske vrednosti BNP Preglednica III: Orientacijske vrednosti probnp Preglednica IV: Delitev bolnikov po spolu in diagnozah Preglednica V: Porazdelitev celotne skupine bolnikov z upoštevanjem starosti in konc. pro-bnp v serumu Preglednica VI: Porazdelitev celotne skupine bolnikov glede na izmerjeno vrednost BNP v serumu Preglednica VII: Porazdelitev bolnikov s sumom na kronično srčno popuščanje z upoštevanjem izključitvenih vrednosti pro-bnp..27 Preglednica VIII: Porazdelitev bolnikov s sumom na kronično srčno popuščanje z upoštevanjem izključitvenih vrednosti BNP Preglednica IX: Koncentracije pro-bnp in BNP pri izbrani skupini bolnikov s akutno ledvično odpovedjo KAZALO DIAGRAMOV Diagram 1: Korelacijska analiza za merjena označevalca (pro-bnp, BNP), (n=78) Diagram 2: Korelacijska analiza pozitivnih vrednosti za oba označevalca (pro-bnp, BNP) (n=61) 24 Diagram 3: Korelacijska analiza za merjena označevalca (pro-bnp, BNP) v skupini bolnikov s sumom na kronično srčno popuščanje, (n=61) Diagram 4: Korelacijska analiza obeh za oba merjena označevalca (pro-bnp, BNP) v skupini bolnikov z akutno ledvično odpovedjo, (n=17)..31 KAZALO PRILOG Priloga 1: Rezultati izmerjenih koncentracij pro-bnp in BNP v serumu 78 bolnikov, ki so sodelovali v naši raziskavi Priloga 2: Rezultati meritev koncentracij pro-bnp z upoštevanjem izključitvene vrednosti..40 Priloga 3: Rezultati meritev koncentracij BNP z upoštevanjem izključitvene vrednosti.40

6 POVZETEK Kronično srčno popuščanje predstavlja v razvitem svetu pomemben in splošni zdravstveni problem. Pojavi se, ko srce ne zmore črpati krvi dovolj učinkovito in tako zagotoviti telesu zadostnega dotoka kisika in hranljivih snovi. Posledica je utrujenost, ki je še posebej izrazita ob telesnem naporu. Ker srce ne črpa dovolj krvi, ta zastaja za srcem, kar povzroča nabiranje tekočine v pljučih in posledično oteţeno dihanje. Slabši pretok skozi ledvice vodi k zadrţevanju tekočine v telesu in nastanku oteklin (nog, trebuha, notranjih organov). Srčno popuščanje se lahko razvije postopoma ali hitro, odvisno od osnovne srčne bolezni. Za ugotavljanje znakov srčnega popuščanja se uporabljajo različne diagnostične preiskave, med drugim tudi merjenje koncentracije natriuretičnih peptidov. Namen naše naloge je bil, da primerjamo uporabnost preiskav na natriuretični in pro-natriuretični peptid v skupini kardioloških bolnikov in tako ugotovimo, ali oba srčna označevalca dobro ocenita stanje bolnika, oziroma ali z negativnimi rezultati lahko izključimo sum na srčno popuščanje. V raziskavo smo vključili vzorce 78 bolnikov, ki smo jih razporedili v dve skupini. V skupini A je bilo 61 bolnikov s sumom na kronično srčno popuščanje, v skupini B pa 17 bolnikov, ki so bili na hemodializi in imeli znake srčnega popuščanja. Vsem bolnikom smo izmerili koncentracijo pro-natriuretičnega peptida (pro-bnp) na imunološkem analizatorju Elecsys (ROCHE) in koncentracijo B-natriuretičnega peptida (BNP) pa na analizatorju Architect (ABBOTT). Izmerjene koncentracije pro-bnp v serumu pri 78 bolnikih so bile višje ( ,16 pmol/l), kot pri izmerjenih koncentracijah BNP v serumu (1443,5 + 2,9 pmol/l). Na koncentracije pro-bnp vpliva tudi starost bolnikov, medtem ko pri BNP starost bolnikov ni bila dejavnik zvišanih koncentracij. Prav tako ni bilo nobene razlike pri zvišanih koncentracij med obema spoloma bolnikov. Od 61 (100%) bolnikov s sumom na kronično srčno popuščanje je imelo kar 41(67%) bolnikov zvišane vrednosti BNP oziroma 52 (84%) bolnikov pa je imelo zvišane vrednosti pro- BNP. Ob upoštevanju samo koncentracij BNP bi spregledali 11 od 61 bolnikov. Od 17 (100%) bolnikov, ki so bili na hemodializi in imeli znake srčnega popuščanja, je imelo kar 15 (88%) bolnikov zvišane koncentracije BNP, vseh 17 (100%) bolnikov pa je imelo zvišane vrednosti pro- BNP. Na podlagi naših rezultatov smo ugotovili, da je povezava celotne skupine med označevalcema srednje močna (r=0,7556), v skupini A je povezava med označevalcema šibka (r=0,4883) in v skupini B je med označevalcema močna povezava (r=0,9031). Povezava samo pozitivnih vrednosti med označevalcema je srednje močna (r=0,7358). Ugotovili pa smo, da je BNP premalo zanesljiv za izključitev diagnoze srčnega popuščanja, saj je imelo kar 11 od 20 bolnikov z nizkimi koncentracijami BNP v klinični sliki znake, povezane z srčnim popuščanjem. Na podlagi rezultatov koncentracij BNP bi lahko izključili sum na srčno popuščanje, vendar pa klinični znaki (ledvična insuficienca, arterijska fibrilacija, akutna odpoved ledvic, stanje po miokardnem infarktu) te izključitve ne dopuščajo. Na podlagi naših meritev sklepamo, da srčna označevalca (pro-bnp in BNP) ne ocenita enako dobro patoloških dogajanj srčnega popuščanja in jih je smiselno uporabljati vzporedno. Ključne besede: kronično srčno popuščanje, moţganski natriuretični peptid in pro-natriuretični peptid i

7 ABSTRACT In a developed world, a chronical heart failure represents an inportant and general health care problem. It breaks out, when the heart doesn't have enough efficiency, to pump the blood so that it can provide enough oxygen affluence and nutritive substances to the body. Tiredness is its consequence, which is clearly visible at physical extertion. Because the heart doesn't pump enough blood the latter stagnates after the heart. That causes the fluid accumulation in the lungs and difficulty in breathing as a consequence. A weaker movement through kidneys leads to fluid accumulation in the body and the begining of swelling (legs, obdomen, internal organs). Heart failure can develope gradually or swiftly, depends upon fundamental heart disease. We can use all sorts of different diagnostic examinations for finding signs of heart failure. One of that kind of research is the measurement of natriuretic peptide concentration. The purpose of our assigment was to compare the research practiability on natriuretic and pronatriuretic peptide in a group of patients with heart - disease. With this kind of research we could find out if both cardiac markers can astimate the condition of a patient, or whether if we can exclude the suspicion on heart failure with negative results. We included a specimen of 78 patients in our research. We devided them into two groups. There were 61 patients in group A with suspicion on chronical heart failure. The other group was group B, that had 17 patients, which were on hemodialysis with signs of heart failure. All the patients were threated the same. The concentration of pro- natriuretic peptide (pro-bnp) was measured on immunoassay analyzer Elecsys (ROCHE), and the concentration of B - natriuretic peptide (BNP), on the Architect analyzer (ABBOT). On 78 patients, the measured concentrations of pro-bnp in the serum were higher ( ,16 pmol/l), as in measured concentration of BNP in the serum (1443,5 + 2,9 pmol/l). The patients age influences on the concentrations of pro-bnp, while with BNP the patients age isn't the factor of increased concentration. Just so, there were no diferences among the sexes. Since 61 (100%) of patients with suspicion on chronical heart failure was having which 41 (67%) of patients increased value BNP respectively 52 (84%) of patients was having of increased value pro-bnp. Having regard to only concentrations BNP overlooked 11 from 61 patients. Since 17 (100%) of patients with hemodialysis with signs of heart failure it had 15 (88%) of patients increased concentrations BNP, of all 17 (100%) of patients was having of increased values. On the basis of our results we established that the connection of the whole group between the markers is of medium power (r=0,7556). The conection between the markers in group A is weak(r=0,4883) and in group B it is strong (r=0,9031). If we look at the positive values only, the conection is medium stong (r=0,7358). We have come to the conclusion that the BNP is not enough reliable for elimination of heart failure diagnosis, it had which 11 from 20 patients with low concentations BNP in clinical picture sign, connected to hearth failure. On the basis of BNP concentration results, we could exclude the suspicion of heart failure, but the clinical signs (kidney insufficiency, arterial fibrousness, acute kidney failure, the condition after the miocardial infarction), don't allowe it. And so our measurements led us to the conclusion, that the heart markers (pro-bnp and BNP), do not evaluate the pathological events of heart failure well enough and it is reasonable to use them parallelly. Key words: Chronical heart failure, brain natriuretic peptide, pro- natriuretic peptide ii

8 SEZNAM OKRAJŠAV CHF ACF EKG UZ NP ANP BNP CNP NT-proBNP pro-bnp SAP AK CMIA Ab1-Ag Ab2* TRIS ECLIA ICON BASEL Ţ M kronično srčno popuščanje (angl. Chronic Heart Failure) akutno srčno popuščanje (angl. Acute Heart Failure) elektrokardiogram ultrazvok natriuretični peptid (angl. Natriuretic Peptide) atrijski natriuretični peptid (angl. Atrial Natriuretic Peptide) moţganski natriuretični peptid (angl. Brain Natriuretic Peptide) natriuretični peptid tipa C (angl. C-type Natriuretic Peptide) N terminalni fragment natriuretičnega pro-peptida tipa B natriuretični pro-peptid tipa B (angl. Pro-Natriuretic Peptide) sistematični arterijski pritisk (angl. Systematic Arterial Pressure) aminokislina kemiluminiscenčna metoda (angl. Chemiluminiscent microparticle Immunoassay) protitelo-antigen označeno protitelo 2-amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol (angl. 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol) elektrokemiluminiscenčna imunska metoda (angl. Electrochemiluminiscence Immunoassay) študijska skupina (angl. International Collaborative of NT-proBNP) študijska skupina (angl. B-type Natriuretic Peptide for Acute Schortness of Breath Evaluation) ţenska moški iii

9 1. UVOD 1.1. ZGRADBA IN DELOVANJE SRCA Srce je votla mišica in pribliţno tako velika kot stisnjena pest. Pri odraslem človeku tehta srce 300 do 350 g in leţi v prsnem košu, nekoliko levo od sredine. Je najpomembnejša mišica v telesu, ki se od rojstva do smrti nenehno krči in razteza ter tako po telesu pošilja hrano v obliki s kisikom obogatene krvi. Kri dobiva po dveh koronarnih ali venčnih arterijah. Arteriji, leva in desna, izhajata iz aorte in kot nekakšen venec obkroţata srce. Odtod tudi njuno ime. Izraz koronaren izhaja iz latinske besede corona, ki pomeni krona ali venec. Leva koronarna arterija je večja od desne in se kmalu razdeli v dve veji. Srce je sestavljeno iz dveh polovic, od katerih je vsaka razdeljena še na zgornji del ali preddvor (atrij) in v spodnji del ali prekat (ventrikel) (Slika 1). Zgornji in spodnji del srca povezujejo zaklopke, ki se med srčnimi utripi odpirajo in zapirajo, ter tako preprečujejo, da bi stekla kri nazaj med utripi. Če naj srce učinkovito deluje, se mora krčiti ritmično; krčenju srca pravimo srčni utrip. Minutni volumen pretoka skozi srce je 5 litrov krvi, tako je vsak dan pribliţno 7000 litrov pretoka krvi skozi srce (1,2). Slika 1: Vzdolţni prerez srca z osnovno zgradbo srca (Povzeto po 1). 1

10 1.2. RAZVOJ BOLEZNI SRCA IN ŢILJA Bolezni srca in ţilja se razvijajo počasi. Pred pojavom teţav so lahko prisotne številne spremembe na strukturah srca in ţilja, ki jih subjektivno še ne čutimo. K razvoju bolezni srca in ţilja prispevajo številni dejavniki, od genetske predispozicije, to je prirojene večje dovzetnosti za nastanek nekega obolenja, virusov ali bakterij, do dejavnikov iz okolja oziroma tistih, ki so povezani z načinom ţivljenja. Predvsem na zmanjšanje škodljivega vpliva slednjih lahko močno vplivamo sami. Če smo dovolj zgodaj seznanjeni z vsemi nevarnostmi, ki nas lahko v prihodnosti ogrozijo, potem lahko močno upočasnimo nastanek obolenja obtočil (3,4). Najpogostejši dejavniki tveganja za razvoj bolezni srca in ţilja so nezdrava prehrana, premalo telesne aktivnosti, debelost, sladkorna bolezen, zvišan krvni tlak, zvišane koncentracije maščob in holesterola v krvi, zvišan krvni sladkor, kajenje in deloma stres (4,5). Bolezni srca in oţilja lahko prizadenejo srčno mišico, srčne zaklopke, venčne arterije, osrčnik ali pa osrednje in periferno ţilje. Zaradi bolezni srca in ţilja lahko obolevajo tudi mlajše osebe, pri katerih so te bolezni praviloma prirojene ali pa so vnetne narave. Velika večina srčnih bolnikov pa so osebe starejše od 40 let, pri njih pa so poglavitni vzroki bolezni ateroskleroza, zvišan krvni pritisk in degenerativne bolezni zaklopk (5) Srčno popuščanje Eno najhujših bolezenskih stanj v kardiologiji, do katerega pripeljejo različni vzroki, je srčno popuščanje (4). Srčno popuščanje (srčna insuficienca, dekompenzacija) je kompleksen klinični sindrom, ki je posledica motenega delovanja srca. Patofiziološko ga opredelimo kot stanje, pri katerem srce ne zmore zagotoviti zadostnega minutnega srčnega iztisa glede na trenutne potrebe v organizmu ali pa ga lahko zagotovi le ob povišanih polnilnih tlakih ali povišani srčni frekvenci. Krčljivost srčne mišice je torej okrnjena, zato se zmanjša količina prečrpane krvi, to pa povzroči padec arterijskega krvnega pritiska. Klinično ga opredelimo kot sindrom simptomov in znakov zaradi povišanih srčnih polnilnih tlakov in/ali nezadostne tkivne prekrvavitve (5,6). Večina znakov popuščanja srca se ugotavlja na drugih organih, redki pa so na samem srcu. 2

11 Na srčno popuščanje opozarja vrsta različnih znakov in teţav kot so dispneja, šibkost, otekanje gleţnjev in nog (periferni edemi), bolečina za prsnico (angina pektoris), izguba apetita in trebušne teţave. Od njihove izrazitosti je odvisno, kakšen vpliv bo imelo srčno popuščanje na ţivljenje (5,6,7). Napredovanje bolezni je povezano z nepovratno okvaro strukture in funkcije srca. Bolniki so vedno pogosteje hospitalizirani in potrebujejo vedno več medicinske obravnave. Nenadna srčna smrt se lahko pojavi na katerikoli stopnji v poteku srčnega popuščanja. Potek napredovanja srčnega popuščanja je prikazan na sliki 2 (8). Slika 2: Napredovanje srčnega popuščanja (Povzeto po 8) Akutno srčno popuščanje (ACF) Pri bolnikih z akutnim srčnim popuščanjem simptomi in znaki nastanejo v nekaj urah ali nekaj dneh. So lahko posledica akutne, novo nastale bolezni ali nenadnega in hudega poslabšanja kronične srčne bolezni. Najpogostejši vzrok ACF je koronarna bolezen s posledično miokardno ishemijo in srčnim infarktom. Privedejo pa še ostale srčne in izvensrčne bolezni, ki so navedene v preglednici I (5). Akutno srčno popuščanje se najpogosteje pokaţe z dispnejo in znaki zastoja v pljučnem obtoku, zato moramo diferencialno diagnostično upoštevati predvsem pljučne bolezni. Nekardiogeni pljučni edem nastane zaradi povečane prepustnosti alveolokapilarne 3

12 membrane, ki je posledica delovanja mediatorjev vnetja pri sepsi in poškodbah ali zastrupitev (heroin, klor ). Takšni bolniki imajo normalno srčno funkcijo in normalne ali nizke polnilne tlake levega prekata. Stanji ločimo z ultrazvočno preiskavo srca in/ali merjenjem hemodinamskih spremenljivk. Tudi okuţbe dihal (pljučnica, akutni bronhitis) in poslabšanje kronične obstruktivne pljučne bolezni potekajo klinično s pospešenim in teţkim dihanjem in lahko dajejo klinični vtis srčnega popuščanja (5). Preglednica I: Najpomembnejši vzroki za nastanek akutnega srčnega popuščanja (5). Miokardna ishemija in akutni miokardni infarkt Zapleti ob akutnem miokardnem infarktu Akutna mitralna regurgitacija (ruptura papilarne mišice) Ruptura medprekatnega pretina Ruptura proste stene prekata s tamponado srca Akutne bolezni mitralne in aortne zaklopke Porast krvnega tlaka Miokarditis Obstojne motnje srčnega ritma Akutna pljučna embolija Akutno poslabšanje kroničnega srčnega popuščanja Toksični in metabolni vplivi (predvsem zdravila) Disekcija aorte z miokardno ishemijo ali infarktom Iz anamnestičnih podatkov moramo predvsem izluščiti simptome sedanjih in tudi prejšnjih srčnih bolezni. Predvsem moramo biti pozorni na morebitno prsno bolečino, ki je lahko znak ishemije srčne mišice, na bolnikovo telesno zmogljivost pred nastankom akutnega srčnega popuščanja, na zdravila, ki jih je bolnik jemal in na spremljajoče bolezni. Prav tako moramo poizvedeti za simptome morebitnih izvensrčnih razlogov za nastanek akutnega srčnega popuščanja (anemija, okuţba, tireotoksikoza, jemanje nekaterih zdravil, pljučni embolizmi) (5). Zdravljenje srčnega popuščanja se je v zadnjem desetletju pomembno spremenilo in je uspešnejše, kot še nedavno. Včasih je zdravljenje temeljilo na spodbujanju opešanega srca k boljšemu delovanju, zdaj pa so, nasprotno, v uporabi zdravil, ki omejijo delovanje srca ter mirijo pretirano aktiviran ţivčni in hormonski sistem. Med takšna zdravila spadajo 4

13 zaviralci angiotenzinske konvertaze (ACE zaviralci), zaviralci beta receptorjev (beta blokatorji) in zaviralci aldosteronskih receptorjev. Zdravila izboljšajo kakovost ţivljenja, deloma pozdravijo oslabljeno srčno mišico, in kar je pomembno, zmanjšajo izjemno visoko umrljivost (5) Kronično srčno popuščanje (CHF) Kronično srčno popuščanje je končna posledica različnih bolezni srca. Srčne bolezni, ki povzročijo kronično srčno popuščanje so visok krvni pritisk, ateroskleroza srčnih (venčnih) ţil, vnetje srčne mišice (miokarditis), oslabelost srčne mišice zaradi številnih vzrokov (kardiomiopatije), prirojene in pridobljene bolezni srčnih zaklopk. Proces kroničnega srčnega popuščanja se prične z okvaro srčne mišice in zmanjšanjem črpalne sposobnosti srca. Okvara črpalne funkcije srca vodi v aktivacijo kroničnih kompenzatornih mehanizmov. Ti privedejo do značilnih hemodinamskih sprememb (povišani polnilni tlaki) in nevrohormonske aktivacije (aktivirata se renin-angiotenzin-aldosteronski sistem in adrenergični sistem). Kompenzatorni mehanizmi v začetnem obdobju srčne bolezni še uspejo ugotoviti ustrezen srčni iztis, nato kljub kompenzatornim mehanizmom črpalna funkcija srca postopno slabi. V terminalnem obdobju srčne bolezni srce ne zmore več zagotoviti niti pretoka, ki bi zadoščal za presnovne potrebe v mirovanju. Pri napredovanju kroničnega srčnega popuščanja ima pomembno vlogo nevrohormonska aktivacija in z njo povezano preoblikovanje levega prekata. Nevrohormonska kompenzatorna aktivacija je namreč preveč izraţena in predstavlja dolgoročno dodatno obremenitev za srce, kar vodi v poslabšanje črpalne funkcije. Povečana obremenitev ter vpliv hormonov in citokinov povzročijo spremembe miocitov in razrast veziva v srčni mišici, prekat se postopno preoblikuje in razširi. Srčna mišica še dodatno oslabi, posledično se še močneje aktivira nevrohormonski sistem in pozitivna povratna zanka je tako sklenjena (5). Simptomi in znaki so po eni strani posledica zmanjšanega minutnega srčnega iztisa in po drugi strani pljučne in sistemske kongestije. Najpomembnejši simptomi so dispneja ob naporu, paroksimalna nočna dispneja, ortopneja, utrujenost,, zmanjšana telesna zmogljivost, otekanje, nikturija. Najpomembnejši znaki pa so obojestranski bazalni poki nad pljuči, prekomerno polnjene vratne vene, tretji ton, tahikardija, vtisljive otekline nog, 5

14 hladne ekstremitete in periferna cianoza, povečana jetra, acites. Klinična slika se razlikuje glede na prisotnost levostranskega, desnostranskega ali obojestranskega popuščanja ter glede na sistoločno in diastolično disfunkcijo (5). Študije nakazujejo, da je pri bolnikih s kroničnim srčnim popuščanjem ob neustreznem zdravljenju pričakovati napredovanje bolezni in v povprečju le še pet let ţivljenja. Preţivetje bolnikov je odvisno od vzroka bolezni in stopnje popuščanja srca: pri hujših oblikah je letna umrljivost celo 50 % (5). Akutno srčno popuščanje se razvije v kratkem času, zato se organizem nanj le deloma prilagodi. Simptomi in znaki so zato mnogo močneje izraţeni, pojavijo pa se pri manjši stopnji okvare srca kot pri kroničnem srčnem popuščanju. Bolniki z akutnim srčnim popuščanjem potrebujejo takojšnjo diagnostično obdelavo, ustrezen nadzor in pravilno ter odločno zdravljenje (5) DIAGNOSTIČNE METODE AKUTNEGA IN KRONIČNEGA SRČNEGA POPUŠČANJA Klinične znake srčnega popuščanja objektivno potrdimo z različnimi diagnostičnimi metodami. Podatke, pridobljene s katerokoli metodo, moramo natančno in kritično vrednotiti, saj drugače lahko privedejo do povsem napačnih terapevtskih odločitev. Diagnostični postopek je končan šele tedaj, ko ugotovimo vzrok za srčno popuščanje in ocenimo ustreznost polnitve obeh prekatov ter zadostnost minutnega srčnega iztisa in transporta kisika. Za diagnostično obdelavo imamo na voljo več preiskavnih metod: elektrokardiografija, rentgenogram, laboratorijske preiskave krvi in ultrazvočne preiskave (5) Laboratorijske preiskave srčnega popuščanja Osnovne laboratorijske preiskave krvi in urina so nam v pomoč predvsem v diferencialni diagnostiki in odkrivanju morebitnih vzrokov poslabšanja srčne funkcije. Koncentraciji sečnine in kreatinina sta pomembni za opredelitev ledvične odpovedi, ki lahko povzroči srčno popuščanje ali se ob njem pojavi, in za vodenje bolnika s srčnim popuščanjem. Merjenje koncentracije natriuretičnih peptidov, predvsem moţganskega, je večinoma ţe del klinične prakse. Koncentracije natriuretičnih peptidov je povišana pri sistolični in 6

15 diastolični disfunkciji in je eden najzanesljivejših prognostičnih kazalcev. Mnenja o napovedni vrednosti pri sumu na disfunkcijo levega prekata so deljena, vendar ga priporočajo kot presejalni test za izključitev, ne pa tudi potrditev srčnega popuščanja. Pri bolnikih z akutnim srčnim popuščanjem ima dobro kratkoročno napovedno vrednost, ugotovili pa so tudi niţjo umrljivost bolnikov s srčnim popuščanjem zaradi srčnoţilnih dogodkov, če so zdravljenje prilagajali serumski koncentraciji moţganskega natriuretičnega peptida (7). Z ostalimi preiskavami lahko ugotovimo spremljajoče bolezni ali stanja (anemija, elektrolitsko neravnovesje, uremija, sladkorna bolezen, hipertiroza, hipoalbuminemija, okuţbe). Posebej velja omeniti plinsko analizo arterijske krvi in raven serumskega laktata, ki sta temeljni laboratorijski preiskavi pri vsakem bolniku z akutnim srčnim popuščanjem. Z njima namreč lahko ugotovimo hipoksemijo, hiperkapnijo in presnovno laktatno acidozo kot posledico hudega srčnega popuščanja z nezadostno tkivno prekrvitvijo (5) Druge preiskave Elektrokardiografija je ena najstarejših kliničnih metod. Je veda, s katero preučujemo delovanje srca na podlagi merjenja potencialnih razlik med različnimi deli telesa ob srčni aktivnosti. Elektrokardiograf je posebna priprava, s katero zaznamo na površini telesa napetostne razlike, ki so posledica majhnih razlik v potencialih med posameznimi predeli v srcu. EKG nam sicer ne daje nobenih neposrednih podatkov o srčni funkciji ali srčnem popuščanju, ampak z njim ugotavljamo oziroma prepoznamo motnje delovanja srca (5). Rentenogram srca in pljuč je še ena izmed laţje dostopnih a nespecifičnih metod. Preiskava je pomembna ob nenadnem poslabšanju srčnega popuščanja, medtem ko je njena vrednost v spremljanju srčnega popuščanja zaradi slabe ponovljivosti in nespecifičnosti majhna (7). Ultrazvočna preiskava srca je rutinska preiskava v diagnostičnem postopku, saj z njo v večini primerov potrdimo ali ovrţemo sum na srčno popuščanje. Opredelimo lahko vrsto srčne disfunkcije, morfološko in funkcionalno stanje zaklopk, dimenzije in debelino sten srčnih votlin (7). 7

16 1.4. SRČNI OZNAČEVALCI PRI KARDIOLOŠKIH BOLNIKIH Natriuretični peptidi Natriuretični peptidi (NP) so druţina molekul, ki jo predstavljajo trije strukturno sorodni peptidi, ki se sproščajo iz srčnomišičnih celic. Količina sproščenih natriuretičnih peptidov je sorazmerna z nategom mišične celice, ki odraţa polnjenost srca. Fiziološka vloga NP je spodbujanje natriureze (izločanja natrija in z njim vode iz organizma), tako da se ob zvečani polnjenosti srca posledično sproţi natriureza, ki odvečno vodo izloči (9). Povečujejo diurezo ter sistemsko vazodilacijo ţilja, s čimer zniţujejo krvni tlak. Druţina natriuretičnih peptidov vključuje (9): - atrijski natriuretični peptid (ANP) - natriuretični peptid tipa B oziroma moţganski peptid (BNP) - natriuretični peptid tipa C (CNP). Glavne biološke funkcije natriuretičnih peptidov so povzročanje natriureze in vazodilacije ter preprečevanje delovanja renina, aldosterona, učinkov simpatičnega ţivčevja in razvoja gladke mišice (10) Moţganski natriuretični peptid (BNP) Natriuretični peptid tipa B (BNP) je bil prvič identificiran leta 1988 z izolacijo iz prašičjih moţganov. Kmalu se je izkazalo, da nastaja v glavnem v srcu in tako danes predstavlja srčni hormon (11, 12). BNP je majhna molekula, sestavljena iz 32 amino kislin (slika 3). Sintetizira se v miocitih prekatov neposredno kot odziv na raztezanje in povečan pritisk na steno prekata (13). BNP kot antagonist renin-angiotenzin-aldosteronskega sistema vpliva na povprečje natriuretičnih in diuretičnih lastnosti, na ravnoteţje vode in elektrolitov v organizmu (14). Je dokaj občutljiv kazalnik disfunkcije levega prekata in diagnostični pokazatelj srčnega popuščanja (15), kar ga lahko uvršča tako med pokazatelje razvoja kronične atrijske fibrilacije kot tudi hemodinamskega stanja srca (16). Je zelo aktiven hormon, ki se hitro izloča s posameznimi mehanizmi: s pomočjo natriuretičnih peptidnih 8

17 receptorjev, encimsko dehidracijo z nevtralno endopeptazo in s pasivnim ledvičnem izločanjem. BNP je biološki kazalec, ki pomaga pri postavitvi diagnoze, napovedi bolezni in pri spremljanju zdravljenja. Določanje koncentracije BNP v serumu predstavlja eno od najpomembnejših diagnostičnih metod pri ugotavljanju srčnega popuščanja. Razvojno gledano gre za najbolj pomembno diagnostično metodo od uvedbe ehokardiografije (5). BNP je del natriuretičnega peptidnega sistema, ki ohranja tekočinsko ravnovesje ter ima podobno strukturo in funkcijo kot ANP. Glavna razlika je ta, da se BNP sintetizira neposredno kot odziv na draţljaj, medtem ko je ANP ţe sintetiziran oziroma ţe uskladiščen v granulih miocitov. Slika 3: Biološko aktivni hormon BNP vsebuje 32 amino kislin. Kroţni peptid s 17 amino kislinami se zapre z disulfidno vezjo v sredini med dvema cisteinskima ostankama (Povzeto po 17). Znano je dejstvo, da koncentracija BNP v plazmi korelira s stopnjo disfunkcije levega prekata pri kroničnem srčnem popuščanju. Izsledki nedavnih raziskav so pokazali, da so zvišane vrednosti BNP prisotne tudi pri disfunkciji desnega prekata v sklopu primarne pljučne hipertenzije, kronične obstruktivne pljučne bolezni in levo-desnega šanta (18). Pri kronični tlačni obremenitvi desnega prekata je vrednost BNP v pozitivnem sorazmerju s srednjim tlakom v pljučni arteriji in negativnim sorazmerjem z minutnim volumnom ter iztisno frakcijo desnega prekata. Višje vrednosti BNP v krvi se kaţejo pri kronični tlačni 9

18 obremenitvi bolj kot pa pri kronični volumski obremenitvi. Podobno je tudi pri akutni obremenitvi desnega prekata kjer so vrednosti BNP v krvi višje kot pri volumskih obremenitvah (19) Princip metode merjenja BNP Koncentracijo BNP v serumu se izmeri imunokemijsko na podlagi kemilumuniscenčne reakcije (CMIA = Chemiluminescent Microparticle Immunoassay). Za analizo biološkega vzorca (seruma) se uporablja imunološki analizator ARCHITECT proizvajalca Abbott, ki omogoča kvantitativno merjenje humanega B-tipa natriuretičnega peptida (BNP) (20). Kemiluminiscentna reakcija predstavlja oksidacijo organskih molekul. Merimo emisijo fotonov, ki jo dajejo produkti kemijske reakcije, pri vračanju iz vzbujenega v osnovno stanje. V prvi stopnji se BNP, ki je prisoten v vzorcu, veţe na mikrodelce, ki so prekriti z anti-bnp protitelesi. Po spiranju z ustrezno raztopino se v mešanico doda sekundarna protitelesa, ki so označena s kemiluminiscentno snovjo in se veţejo na kompleks Ab1-Ag (Slika 4). Kot kemiluminiscentno snov se uporablja akridinijeve estre (20, 21). Imunokemijski test je nekompetativni dvostranski test (»sendvič«test). Slika 4: Princip metode CMIA (Povzeto po 21). 10

19 Preglednica II: Orientacijske vrednosti BNP (22,23,24) OPTIMALNE KLINIČNO STANJE RAZMEJITVENE VREDNOSTI < 28,9 pmol/l Normalno (srčno popuščanje ni prisotno) 28,9 144,5 pmol/l Sum na srčno popuščanje >144,5 pmol/l Dekompenzacija kongenstivnega srčnega popuščanja Natriuretični pro-peptid (pro-bnp) Pro-BNP je prohormon, sestavljen iz 108 amino kislin (Slika 5). Uporablja se kot pomoč pri diagnozi srčne poškodbe in blagih oblik srčne disfunkcije. V glavnem se izloča iz levega srčnega ventrikla in se cepi na fiziološko aktiven BNP ( AK) in N-terminalni fragment NT-proBNP (1-76 AK). NT-proBNP je sestavljen iz 76 amino kislin, je biološko neaktiven. Rezultati dosedanjih študij kaţejo, da se lahko NT-proBNP uporablja tako pri diagnostičnih kot tudi pri prognostičnih aplikacijah. Koncentracija NT-proBNP v serumu in plazmi kaţe na disfunkcijo levega ventrikla. Uporablja pa se tudi pri določitvi simptomov srčnega ali nesrčnega vzroka. Spremembe v koncentraciji NT-proBNP lahko uporabimo za spremljanje uspešnosti zdravljenja pri bolnikih z disfunkcijo levega ventrikla. NT-proBNP je zaradi svoje funkcije primeren za uporabo pri ocenitvi ţilnega preoblikovanja. Je tudi pomemben pokazatelj dolgoročne umrljivosti pri bolnikih s SAP in sicer neodvisno od obsega koronarnih sprememb ali delovanja levega prekata (14). Slika 5: prohormon pro-bnp (108 ak) (Povzeto po 15). 11

20 S povečano koncentracijo BNP in NT-proBNP so povezana različna bolezenska stanja: srčno popuščanje, miokardni infarkt, vnetje srčne mišice, Kawasakijeva bolezen, primarna pljučna hipertenzija, ledvično popuščanje. Pro-hormon (probnp AK ) se razcepi v notranjosti miocita z proteazo furin v fiziološko aktiven C-terminalen fragment BNP 1-32 AK in biološko neaktiven N-terminalni fragment NT-proBNP 1-76 AK (Slika 6). BNP ima biološki čas v krvnem obtoku 20 minut - odvisno od ledvične funkcije, medtem ko ima NT-proBNP daljši razpolovni čas od 60 do 120 minut, zaradi česar je NT-proBNP bolj stabilen kot BNP. Glavna pot izločanja BNP v krvni obtok je eksocitoza preko natriuretičnega peptidnega receptorja C in z encimsko dehidracijo z nevtralno endopeptidazo, medtem ko se NT-proBNP izloča skozi retikuloendokrini sistem in preko ledvic (15). Slika 6: Sinteza BNP in NT-proBNP (Povzeto po15). Koncentracijo NT-proBNP merimo pri ugotavljanju ter postavitvi prognoze disfunkcije levega ventrikla, za določitev uspeha zdravljenja pri bolniku z disfunkcijo levega ventrikla, pri določitvi simptomov srčnega in nesrčnega vzroka, oceni ţilnega preoblikovanja, pljučnih boleznih, kadar gre obenem za disfunkcijo desnega prekata in v zgodnjem obdobju miokardnega infarkta, saj je zvišana koncentracija močan napovedovalec kasnejše disfunkcije levega prekata in umrljivosti. 12

21 Princip metode merjenja pro-bnp Merjenje koncentracije pro-bnp v serumu poteka imunokemijsko na podlagi elektrokemiluminiscentne reakcije (ECLIA = electrochemiluminiscence immunoassay). Koncentracijo pro-bnp se meri na imunološkem analizatorju Elecsys 2010 proizvajalca Roche, ki omogoča kvantitativno merjenje N-terminalnega konca molekule pro-bnp (NTproBNP). Osnova reakcije je nastanek kompleksa antigen-protitelo, ki se ga določi z označenimi protitelesi (sendvič tehnika). V reakciji nastane tok elektronov, ki se meri, ko elektroni prehajajo iz vzbujenega v osnovno stanje in se s pomočjo fotopomnoţevalke in ustreznega računalniškega programa avtomatično pretvori v koncentracijo pro-bnp (25). Preglednica III: Orientacijske patološke vrednosti pro-bnp po starostnih skupinah (26): Kategorija Optimalna razmejitvena vrednost < 50 let 53,1 pmol/l let 106,2 pmol/l > 75 let 212,4 pmol/l 13

22 2. NAMEN Bolezni srca in ţilja so nedvomno velik problem civilizacije, saj zaradi njih zboleva in umira največ ljudi. Srčno popuščanje, ki je lahko posledica različnih vzrokov, je v kardiologiji eno najhujših bolezenskih stanj. Za ugotavljanje znakov srčnega popuščanja se uporabljajo različne diagnostične metode, med drugim tudi določanje koncentracije natriuretičnih peptidov. Namen naše naloge je primerjava uporabnosti preiskav na natriuretični in pro-natriuretični peptid v skupini kardioloških bolnikov. Ugotoviti nameravamo, ali oba srčna označevalca dobro ocenita stanje bolnika oziroma, ali z negativnimi rezultati lahko izključimo sum na srčno popuščanje. V naši nalogi bomo vzporedno v istih vzorcih merili koncentracije pro-bnp in BNP pri bolnikih, ki imajo veliko tveganje za razvoj kroničnega srčnega popuščanja. Koncentracijo pro-bnp bomo merili na imunološkem analizatorju Elecsys (ROCHE), BNP pa na analizatorju Architect (ABBOTT). Bolnike bomo razdelili v dve skupini: v prvi bodo bolniki, ki bodo v urgentni ambulanti obravnavani zaradi znakov in suma na kronično ishemično bolezen, v drugi pa bolniki na hemodializi, ki kaţejo znake srčnega popuščanja. 14

23 3. MATERIALI IN METODE 3.1. PREISKOVANCI V raziskavi smo uporabili serumske vzorce krvi 78 bolnikov (50% moških in 50% ţensk), ki smo jih razporedili na dve podskupini glede na postavljeno diagnozo (preglednica IV, slika 7): - skupino bolnikov s sumom na kronično srčno popuščanje (CHF) (A) - skupino dializnih bolnikov, ki imajo znake srčnega popuščanja (B). Povprečna starost vseh preiskovancev je bila 69,5 let (43-96), povprečna starost moških je znašala 70 let, povprečna starost ţensk pa 72 let. Raziskava je potekala v Diagnostičnem laboratoriju v Splošni Bolnišnici Novo mesto. Preglednica IV: Delitev bolnikov po spolu in diagnozah SPOL CELOTNA SKUPINA SKUPINA A SKUPINA B Moški 39 ( 50%) 31 (50,8%) 8 ( 47%) Ţenski 39 ( 50%) 30 ( 49,2%) 9 ( 53%) SKUPAJ 78 (100%) 61 (100 %) 17 (100%) moški ženske skupaj Celotna skupina Skupina A Skupina B Slika 7: Grafični prikaz bolnikov po skupinah in spolu 15

24 Izvajali smo vzporedna merjenja koncentracij pro-bnp in BNP v istih serumskih vzorcih vsem bolnikom ZBIRANJE IN PRIPRAVA VZORCEV Kri je bila odvzeta po standardnem postopku za vakumski odvzem, za katerega smo uporabili epruvete brez antikoagulantnih sredstev (rdeč zamašek). 30 minut po odvzemu krvi smo vzorce centrifugirali 10 minut pri centrifugalni sili 1372 x g in s tem ločili strdek od seruma. Kontrolni in serumski vzorci so bili pred določitvijo na sobni temperaturi (20-25 C). Stabilnost vzorcev je 3 dni pri C ali 6 dni pri 2-8 C lahko pa tudi 12 mesecev pri - 20 C. Z vsemi vzorci smo ravnali, kot potencialno kuţnimi vzorci in s tem zmanjšali moţnost okuţbe. Analize smo izvedli v dveh serijah (po skupinah bolnikov) na obeh analizatorjih. Medicinske podatke o bolnikih, o katerih smo v nadaljevanju razpravljali, smo pridobili s pomočjo računalniškega arhiva v Diagnostičnem laboratoriju v Splošni bolnišnici Novo mesto KONTROLA KAKOVOSTI Notranjo kontrolo kakovosti smo izvajali s priporočenimi kontrolnimi vzorci pred vsako rutinsko analizo. Kontrolni interval je moral biti prilagojen potrebam vsakega laboratorija. Dobljene vrednosti so bile znotraj definiranega območja. Če so vrednosti kontrolnega vzorca odstopale od priporočenih vrednosti, smo aparat kalibrirali in ponovno izvedli notranjo kontrolo kakovosti. V naši raziskavi smo pred vsako serijo analiz iz vzorcev bolnikovih krvi izvedli kontrole v dveh koncentracijskih območjih (na obeh analizatorjih). Rezultati kontrol so bili v predpisanem območju. 16

25 3.4. METODE Merjenje koncentracije B-tip natriuretičnega peptida (BNP) Koncentracijo BNP v serumu smo izmerili z imunološkim analizatorjem ARCHITECT proizvajalca Abbott. Merjenje BNP poteka imunokemijsko na podlagi kemilumuniscenčne reakcije (CMIA = Chemiluminescent Microparticle Immunoassay) (20). Postopek: Analizator odpipetira vzorec in ga nanese na mikrodelce, ki so prekriti s protitelesi (Ab1) anti-bnp. Nato se dodajo še označena protitelesa (Ab2*), ki se veţejo na nastali kompleks Ab1 Ag. Sledi inkubacija reakcijske zmesi pri določenih pogojih, ki jih predpiše proizvajalec analizatorja. Čas inkubacije je 29 minut. Po končani inkubaciji sledi spiranje prebitka Ab2* in nato meritev luminiscence, ki je sorazmerna s koncentracijo BNP-ja v vzorcu. Rezultate izrazimo v pmol/l (20). Reagenti (20): ARCHITECT BNP reagent Kit 100 testov M 1 steklenička vsebuje mikrodelce prevlečene z anti-bnp mišjimi protitelesi v TRIS pufru z proteinskim stabilizatorjem. R1 R2 Konzervansi: Natrijev azid in ProClin 950. Je konjugat. 1 steklenička vsebuje anti BNP mišja protitelesa označena (konjugirana) z akridinijevim indikatorjem v MES pufru s proteinskim stabilizatorjem. Minimalna koncentracija je 0,1 μg/ml.. Konzervansi: natrijev azid in ProClin steklenička vsebuje razredčilo, ki vsebuje TRIS pufer s proteinskim stabilizatorjem. Konzervansi: Natrijev azid in ProClin

26 Merjenje koncentracije natriuretičnega pro-peptida (pro-bnp) Koncentracijo pro-bnp v serumu smo izmerili z uporabo elektrokemiluminiscentne imunoanalize (ECLIA) na imunološkem analizatorju Elecsys 2010 proizvajalca Roche. Postopek: Uporabljali smo sendvič-tehnika: 1. inkubacija: antigen pro-bnp iz vzorca, biotin poliklonalni NT-proBNPspecifično protitelo in poliklonalno NT-proBNP-specifično protitelo označeno z rutenijevim kompleksom ** tvorijo sendvič kompleks. Čas inkubacije je 9 minut. 2. inkubacija: po dodatku s streptavidinom označenih mikrodelcev se kompleks veţe na trdno fazo preko medsebojnega delovanja biotina in streptavidina. Čas inkubacije 9 minut. Po drugi inkubaciji nastane reakcijska mešanica (slika 8), ki se prenese v merilno celico, kjer se mikrodelci magnetno ujamejo na površino elektrode. Nevezane substance se odstranijo z reagentom ProCell. Napetost elektrode nato povzroči kemiluminiscentno emisijo, ki se meri s fotopomnoţevalko (25). Slika 8: Princip metode sendvič tehnike (Povzeto po 25). 18

27 Reagenti: Za analizo vzorcev smo uporabili predpisan reagent Elecsys probnp, uporaben za 100 testov, ki je sestavljen iz: M 1 steklenička (prozoren pokrovček) vsebuje mikrodelce prevlečene s steptavidinom 0,72 mg/ml;vezavna kapaciteta: 470ng biotina / mg mikrodelcev. R1 1 steklenička Anti-NT-proBNP- Ab-biotin (siv pokrovček) vsebuje Biotin poliklonalna anti-nt-probnp protitela (ovčja) v koncentraciji 1,5 μg/ml; fosfatni pufer 40 mmol/l, ph 7,4 R2 1 steklenička Anti-NT-proBNP-Ab-Ru(bpy) 2-3 (črn pokrovček) vsebuje poliklonalna anti-nt-probnp protitela (ovčja) označena s kompleksom, ki vsebuje Rutenij v koncentraciji1,7 μg/ml; fosfatni pufer 40 mmol/l, ph 7,4 Reagent za probnp shranjujemo pri 2-8 C v pokončnem poloţaju, da zagotovimo popolno uporabo mikrodelcev med avtomatskem mešanjem pred uporabo. Reagent je po odprtju, v ohlajenem delu aparata stabilen 8 tednov (14) STATISTIČNO VREDNOTENJE Za izdelavo grafov in SD+X smo uporabili program Excel Windows in za izračun korelacijske analize smo uporabili statistični program MedCalc. 19

28 4. REZULTATI IN RAZPRAVA 4.1. REZULTATI MERITEV KONCENTRACIJ pro-bnp in BNP Rezultati posameznih meritev BNP in probnp v 78 vzorcih seruma so zbrani v prilogi 1. Vsi rezultati so podani v pmol/l Rezultati analiz ob upoštevanju napovednih vrednosti pro-bnp za CHF Naše rezultate izmerjenih koncentracij pro-bnp smo razdelili v navedene 3 optimalne razmejitvene vrednosti, ki so jih postavili strokovnjaki študijske skupine ICON (International Collaborative of NT-proBNP) (preglednica V, slika 9) (26). Vrednost probnp (pmol/l) Starost Število bolnikov pod to vrednostjo Število bolnikov nad to vrednostjo Skupno število bolnikov 53,1 pmol/l < 50 let 3 (15%) 5 (9%) 8 (10%) 106,2 pmol/l let 8 (40%) 26 (45%) 34 (44%) 212,4 pmol/l > 75 let 9 (45%) 27 (46%) 36 (46%) SKUPAJ 20 ( 100%) 58 (100%) 78 (100%) Preglednica V: Porazdelitev celotne skupine bolnikov z upoštevanjem starosti in konc. pro-bnp v serumu. Ugotovili smo, da se koncentracija pro-bnp povečuje s starostjo, vrednosti pri starosti nad 50 let se močno zvišujejo. Najvišja izmerjena koncentracija pro-bnp je bila pmol/l, kar je za 68 letno ţensko bolnico zelo močno zvišana vrednost od orientacijskih patoloških vrednosti. Najniţja izmerjena koncentracija je bila 5,16 pmol/l, kar je za 47 letnega moškega bolnika normalna vrednost. Spol bolnika pri naših meritvah za probnp v serumu nima nobenega vpliva na zvišane izmerjene koncentracije (50% ţensk in 50% moških ima zvišane izmerjene vrednosti pro-bnp). V prvi kategoriji je bilo 8 (10%) bolnikov, mlajših od 50 let. Od tega so bili 3 bolniki, ki so imeli koncentracijo pod 53,1 pmol/l s povprečno koncentracijo 25,83 pmol/l in povprečno starostjo 48,3 let in 5 bolnikov, ki so imeli koncentracijo nad 53,1 pmol/l, s povprečno koncentracijo 4282,3 pmol/l in povprečno starostjo 46,8 let. 20

29 V drugi kategoriji je bilo 34 (44%) bolnikov starih od let in od tega je bilo 8 bolnikov z izmerjenimi koncentracijami pod 106,2 pmol/l. Ti so imeli povprečno izmerjeno koncentracijo 49,9 pmol/l in starost 63,7 let. 26 bolnikov je imelo izmerjeno koncentracijo nad 106,2 pmol/l, s povprečno vrednostjo 2684 pmol/l in povprečno starostjo 64,9 let. V tretji kategoriji je bilo 36 (46%) bolnikov starejših od 75 let. Od tega je bilo 9 bolnikov z izmerjeno koncentracijo pod 212,4 pmol/l, s povprečno koncentracijo 87 pmol/l in povprečno starostjo 78,4 let in 27 bolnikov z izmerjenimi koncentracijami nad 212,4 pmol/l, s povprečno koncentracijo 2379,7 pmol/l in starostjo 81,6 let (Slika 9). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% Število bolnikov nad pražno vrednostjo Skupina bolnikov pod pražno vrednostjo 30% 20% 10% % do 50 let let nad 75 let Slika 9: Grafična porazdelitev celotne skupine bolnikovih vzorcev glede na izmerjene koncentracije pro-bnp z upoštevanjem starosti. Glede na najnovejše literaturne podatke (21, 26, 27) pro-bnp lahko z upoštevanjem starosti, bolnike/preiskovance razdelimo v tri kategorije z napovednimi vrednostmi probnp za kronično srčno popuščanje. Prva diagnostična napovedna koncentracija probnp za kronično srčno popuščanje (CHF), ki velja za bolnike pod 50 let je 53,1 pmol/l. Druga za starostno skupino let je 106,2 pmol/l. Tretja diagnostična napovedna koncentracija pro-bnp v kateri so starostniki nad 75 let je 212,4 pmol/l (Preglednica V). 21

30 Rezultati analiz ob upoštevanju napovednih vrednosti BNP za CHF Naše rezultate smo razdelili v navedene 3 skupine z optimalnimi razmejitvenimi vrednostmi, ki jih je postavila študijska skupina BASEL (B-Type Natriuretic Peptide for Acute Shortness of Breath Evaluation (preglednica VI, slika 10) (15,16, 21). VREDNOST BNP (pmol/l) CELOTNA SKUPINA BOLNIKOV < 28,9 pmol/l 22 (28%) 28,9 144,5 pmol/l 38 (49%) > 144,5 pmol/l 18 (23 %) SKUPAJ 78 (100%) Preglednica VI: Porazdelitev celotne skupine bolnikov glede na izmerjeno vrednost BNP serumu. Naši bolniki po starosti imajo različno zvišane izmerjene koncentracije. Najvišja starost je 93 let in ima izmerjeno koncentracijo 27,9 pmol/l v mejah priporočenih vrednosti. Najniţja starost je 43 let in ima izmerjeno koncentracijo 214,0 pmol/l nad zgornjo priporočeno vrednost. Na podlagi naših rezultatov lahko sklepamo, da starost bolnikov nima vpliva na izmerjene rezultate koncentracij BNP. Najvišja izmerjena koncentracija BNP v serumu je bila 1443,5 pmol/l, kar je za 68 let staro ţensko bolnico zelo zvišana izmerjena vrednost od priporočenih. Najniţja izmerjena koncentracija BNP v serumu je bila 2,9 pmol/l. To izmerjeno vrednost so imeli kar 4 bolniki (50% ţensk in 50% moški). Njihova povprečna starost je bila 69 let, kar je ta izmerjena vrednost za njihova leta zelo dobra, saj je v mejah normalnih priporočenih vrednosti. Drugače pa izmerjene vrednosti BNP nismo delili po starostnih kategorijah, ker znanstveniki priporočajo delitev z upoštevanjem napovednih vrednosti, ki so rezultat velikih populacijskih študij. Glede na te podatke imamo 3 kategorije za diagnosticiranje kroničnega srčnega popuščanja (CHF). Vrednost BNP < 28,9 pmol/l kaţe na izključitev kroničnega srčnega popuščanja (negativna napovedna vrednost, večja kot 90%), medtem ko BNP vrednost > 144,5 pmol/l kaţe na zelo verjetno srčno bolezen (pozitivna napovedna vrednost, večja kot 90 %) (Silver e tal., 2004). Vmesna vrednost BNP, med 28,9 pmol/l in 144,5 pmol/l kaţe na večjo verjetnost srčnega popuščanja. V normalnem območju BNP vrednosti je 22 (28%) bolnikov s povprečno koncentracijo 11,9 pmol/l in s povprečno starostjo 68,5 let, medtem ko je 38 (49%) bolnikov z 22

31 vrednostjo med 28,9 144,4 pmol/l. Ti bolniki imajo povprečno koncentracijo 72,68 pmol/l in starostjo 70,2 let. Zvišane koncentracije BNP ima 18 (23%) bolnikov s povprečno koncentracijo 484,2 pmol/l in starostjo 69,6 let Število bioloških vzorcev < 28,9 pmol/l 28,9 144,5 pmol/l > 144,5 pmol/l 5 0 BNP koncentracije (pmol/l) Slika 10: Grafični prikaz porazdelitve celotne skupine bolnikovih vzorcev v kategorije glede na izmerjene koncentracije BNP. Glede na rezultate naše raziskave bi lahko sklepali, da je skoraj polovica (49%) preiskovancev v skupini z velikim tveganjem za pojav srčnega popuščanja in le 28%, katerim bi lahko izključili srčno popuščanje, zato smo pri nadaljnji obdelavi naše rezultate razdelili v dve skupini upoštevajoč izključitvene vrednosti (praţna vrednost) za oba parametra. Pri izračunu povprečnih vrednosti izmerjenih koncentracij pri pro-bnp smo ugotovili zelo zvišane povprečne vrednosti kot pri BNP. Ugotovili smo, da imata oba natriuretična peptida najbolj zvišano in zniţano izmerjeno koncentracijo v istem biološkem vzorcu. BNP ima še tri enake zniţane izmerjene koncentracije ampak v različnih vzorcih Korelacija obeh označevalcev Analizo korelacij smo izvedli, da bi ocenili moč povezave (korelacija) med rezultati za pro-bnp in BNP. Uporabili smo korelacijsko analizo. V analizo smo vključili podatke preiskav vseh 78 bolnikov (Diagram 1). Analizirali smo še pozitivne vrednosti za oba 23