Įprastinė kintama agamaglobulinemija: diagnostika ir gydymo galimybės

Transcription

1 Įprastinė kintama agamaglobulinemija: diagnostika ir gydymo galimybės Common variable immunodeficiency: diagnosis and treatment possibilities Audra Blažienė, Kęstutis Černiauskas Vilniaus universiteto Krūtinės ligų, alergologijos ir radiologijos klinika Vilnius University Clinic Thoracic deaseases, Allergology and Radiology SANTRAUKA Reikšminiai žodžiai: įprastinė kintama agamaglobulinemija, besikartojančios infekcijos, imunoglobulinas. Viena dažniausių pirminių imunodeficitinių būklių įprastinė kintama agamaglobulinemija ypatinga tuo, kad gali pasireikšti ne tik vaikystėje, bet ir vyresniame amžiuje, dažniausiai antrąjį ar trečiąjį gyvenimo dešimtmetį. Straipsnyje aprašoma liga, su ja susijusios patologijos, besikartojančių infekcijų sukeltos komplikacijos, diagnostikos ir gydymo ypatumai. Pateikiami klinikiniai atvejai, pabrėžiantys ankstyvo ligos nustatymo ir pakaitinės terapijos imunoglobulinais svarbą. ABSTRACT Key words: common variable immunodeficiency, recurrent infections, immunoglobulin. Common variable immunodeficiency (CVID) is one of the most frequent primary immunodeficiency conditions. Patients with CVID are recognized to have immunodeficiency not only in a childhood, but also in the second or third decade of life. The course of the disease, its complications, diagnostic and treatment peculiarities are described in this article. ĮVADAS Įprastinė kintama agamaglobulinemija (ĮKAG) tai heterogeninė patologija, kai dėl sumažėjusio imunoglobulinų (IgG, IgA, o kartais ir IgM) kiekio kraujo serume pacientams dažnai kartojasi bakterinės infekcijos [1]. Ši patologija vienas dažniausių pirminių imunodeficitų, sudarantis didžiausią visų hipogamaglobulinemijų dalį. Ji pasitaiko 1 2 iš gyventojų [1]. Taigi Lietuvoje turėtų būti apie šia liga sergančių žmonių, tačiau ši patologija nustatoma kur kas rečiau. Jeffrey Model Foundation pateikia dešimt požymių, kada reikia įtarti imunodeficitą (1 lentelė) [10]. Ir vyrai, ir moterys ĮKAG serga vienodai dažnai. Liga gali pasireikšti įvairiame amžiuje, bet dažniausiai antrąjį ir trečiąjį gyvenimo dešimtmetį. Atliekant epidemiologinius tyrimus pastebėtas ligos bifaziškumas 6 10 ir metų amžiuje [1]. Tai nėra iš karto sunkiai pasireiškianti ir gyvybei gresianti liga kaip, pavyzdžiui, ūmus kombinuotas imu- 1 lentelė. 10 požymių, leidžiančių įtarti pirminį imunodeficitą [10] Aštuonios ar daugiau infekcinių ligų per 1 metus Du (ir daugiau) sunkūs sinuitai per 1 metus Du (ir daugiau) plaučių uždegimai per metus Dvi (ar daugiau) gilios arba neįprastos lokalizacijos infekcijos Pasikartojantys odos ar kitų organų abscesai Intraveninių antibiotikų poreikis infekcijai gydyti Antibiotikų vartojimas 2 mėnesius ir ilgiau be žymaus efekto Šeiminė anamnezė Sutrikęs vaiko augimas, nepakankamas svorio didėjimas Persistuojanti burnos ar odos kandidozė vienerių metų amžiuje Audra Blažienė VU Krūtinės ligų, alergologijos ir radiologijos klinika Santariškių g. 2, Vilnius audra.blaziene@santa.lt teorija ir praktika T. 17 (Nr. 2), p. Copyright 2011 MEDICINOS TEORIJA IR PRAKTIKA. ISSN All rights reserved. 221

2 nodeficitas, tačiau laiku jos nediagnozavus besikartojančios infekcijos tampa lėtinės, negrįžtamai pažeidžiami įvairūs organai [2]. Dauguma atvejų yra spontaniniai. Tik 10 proc. imunodeficitu sergančių pacientų turi šeiminę anamnezę. Tais atvejais dažnesnis autosominis dominantinis paveldėjimo būdas [3]. Yra pastebėta, kad tarp giminaičių dažniau pasitaiko selektyvus IgA deficitas (kurį turi 1 iš visų žmonių) ir autoimuninės ligos. Retais atvejais selektyvus IgA deficitas gali progresuoti iki ĮKAG [3]. Tiksli ligos priežastis nežinoma. Tai heterogeninė patologija, nulemta ne tik B limfocitų, bet ir T limfocitų defektų, sutrikusios ląstelinio ir humoralinio imuniteto tarpusavio sąveikos ar antigeną pateikiančių ląstelių defektų [6]. KLINIKINIS PASIREIŠKIMAS ĮKAG, kaip ir kitoms imunodeficitinėms ligoms, būdingos besikartojančios ir sunkiai gydomos infekcijos. Dažniausios yra kvėpavimo takų bakterinės infekcijos (pneumonijos, bronchitai, sinuitai, vidurinės ausies uždegimai) sukeltos S.pneumoniae, Moraxella catarrhalis ir Haemophilus influenzae. Pastarasis yra dažniausiai iš skreplių išauginamas sukėlėjas [1]. Organizmo atsakas į virusinę infekciją dažniausiai lieka nepažeistas, išskyrus didesnį jautrumą herpes simplex, varicella zooster ir citomegalo virusams [1]. Retais atvejais sunkų meningoencefalitą gali sukelti enterovirusai. ĮKAG sergantiems žmonėms pavojingesnis hepatito C virusas [7]. Pacientai jautresni mikoplazminei, ypač kvėpavimo takų, infekcijai (M.pneumoniae, U.urealyticum). Šie sukėlėjai buvo išskirti ir iš šlapimo, odos bei sinovinio skysčio. Antikūnų deficitą turintiems žmonėms mikoplazminė infekcija yra dažniausia lėtinio erozinio artrito priežastis [1]. Virškinamąjį traktą pažeidžia Giardia lamblia, bet galimi ir kiti patogenai Salmonella, Campylobacter ir Schigella štamai. Be padidėjusio jautrumo bakterinėms infekcijoms, šie ligoniai dažniau serga autoimuninėmis ligomis ir navikais. Ne Hodžkino limfomos diagnozuojamos apie 30 kartų dažniau, o skrandžio vėžys net 47 kartus dažniau nei bendroje populiacijoje [1]. Apie proc. ligonių diagnozės nustatymo metu ar vėliau išsivysto autoimuninė patologija, kuri dėl neaiškių priežasčių dažnesnė moterims [8]. Tai autoimuninė hemolizinė anemija, idiopatinė trombocitopeninė purpura, reumatoidinis artritas, sisteminė raudonoji vilkligė, autoimuninis tiroiditas, vitiligo, pirminė biliarinė cirozė [5]. Ligoniams su labai mažu ir netgi neaptinkamu imunoglobulinų, nukreiptų prieš išorės antigenus, kiekiu nustatomas didelis autoantikūnių titras [4]. Gerybinės limfoproliferacinės ligos taip pat dažnos sergantiems ĮKAG. 1/3 pacientų ji pasireiškia splenomegalija, intestinine limfoidine hiperplazija, abdominaline, tarpuplaučio ar periferine limfadenopatija [1, 4]. Nuo 5 iki 10 proc. pacientų nustatomi granulominiai limfinio audinio, plaučių, odos ir kitų organų pokyčiai. Nereta į sarkoidozę panaši patologija [1] proc. ligonių pasireiškia neinfekcinė gastrointestininė patologija: limfmazgių hiperplazija, uždegiminės žarnų ligos (Krono liga, opinis kolitas), nespecifinė malabsorbcija, achlorhidrija [1]. Besikartojančios bakterinės apatinių kvėpavimo takų infekcijos sukelia tokias komplikacijas kaip plaučių fibrozė ir bronchektazinė liga. Retesnė ĮKAG komplikacija amiloidozė, paprastai pasireiškianti nefroziniu sindromu. Biopsijos metu nustatomos AA tipo amiloido sankaupos, būdingos antrinei amiloidozei [1]. 4 iš 5 VULSK gydytų pacientų diagnozės nustatymo metu buvo ligos komplikacijų, net trims iš jų nustatyta AA tipo amiloidozė, kuri priskiriama retesnėms komplikacijoms. DIAGNOSTIKA Imuninės sistemos pažeidimą reikia įtarti visiems pacientams su besikartojančiomis bakterinėmis infekcijomis, atkreipiant dėmesį į infekcijos lokalizaciją, tipiškus sukėlėjus, taikytą gydymą, atsaką į jį ir šeiminę anamnezę bei kitas 2 lentelė. Antrinės hipogamaglobulinemijos priežastys [2] Hematologinės ligos Lėtinė limfoleukemija Waldenströmo makroglobulinemija Daugybinė mieloma Limfoma Pirminė amiloidozė Kitos priežastys Vaistų sukelta (fenitoinas, aukso preparatai, ciklofosfamidas, penicilaminas) hipogamaglobulinemija Su baltymų netekimu susijusi enteropatija/intestininė limfangiektazija Lėtinė intestininė pseudoobstrukcija Nefrozinis sindromas Transplantacija Splenektomija 222 teorija ir praktika T. 17 (Nr. 2)

3 3 lentelė. Pirminiai humoraliniai imunodeficitai [1] - Su X chromosoma susijusi (Brutono) agamaglobulinemija - Autosominė recesyvinė agamaglobulinemija - Įprastinė besikeičianti agamaglobulinemija - Specifinis Ig A deficitas - Ig G sublasių deficitas - Tranzitorinė kūdikystės hipogamaglobulinemija - Hiper-IgM sindromas ligas. Fizinės apžiūros metu galima nustatyti limfadenopatiją, splenomegaliją ar limfmazgių padidėjimą. Radiologinis tyrimas svarbus diagnozei patikslinti, jos dokumentacijai, nuolatinės infekcijos sukeltoms komplikacijoms (pvz., bronchektazėms) įvertinti [4]. ĮKAG diagnozei nustatyti svarbu ekskliuduoti visas kitas galimas hipogamaglobulinemijos priežastis (2 lentelė). Laboratoriniai tyrimai, be jokios abejonės, yra labai svarbūs patvirtinant ĮKAG diagnozę. Paprastesniais ir pigesniais metodais aptikti pokyčiai nurodo, kad reikalingi sudėtingesni tyrimai [1]. Pirmiausia įvertinama: kraujo serumo IgG, IgA, IgM kiekis; klinikinis kraujo tyrimas (galima anemija, trombocitopenija, leukopenija ar leukocitozė); kraujo baltymai ir jų frakcijos (nustatomas baltymų netekimo sindromas); šlapimo elektroforezė (proteinurijos, paraproteinemijos nustatymui); bendras komplemento lygis (CH50) (komplemento sistemos deficitui paneigti). Papildomi tyrimai: limfocitų fenotipavimas (kiekybiškai įvertinamas ląstelinis ir humoralinis imunitetas) o B limfocitai (CD19, CD20) jų nebuvimas ir vyriška lytis gali nulemti su X chromosoma susijusios agamaglobulinemijos diagnozę. o T limfocitai (CD3,CD4,CD8). Organizmo atsakas į vakcinaciją: o proteininėmis vakcinomis (stabligės ir difterijos toksoidai, B tipo H.influenzae konjuguota vakcina); o polisacharidinėmis vakcinomis (pneumokokinė vakcina, meningokokinė vakcina). Specialūs tyrimai: imunoglobulinų produkcija po stimuliacijos antigenais ir mitogenais in vitro; CD40 ekspresija ant aktyvuotų T limfocitų (hiper-igm sindromo nustatymas); limfocitų proliferacijos tyrimas naudojant antigenus (pvz., stabligės toksoidą), mitogenus (ConA konkavaliną, PHA fitohemagliutininą). Pagrindinis kriterijus yra IgG, IgA ir/arba IgM kiekio sumažėjimas, blogas organizmo atsakas į stimuliaciją baltyminėmis ir polisacharidinėmis vakcinomis, kitų galimų hipogamaglobulinemijų paneigimas. Serumo IgG kiekis būna mažesnis nei 3 g/l arba 2 SD amžiaus normos. Klinikinio kraujo tyrimo rodikliai gali būti be pakitimų. Apie 20 proc. galima limfopenija, B limfocitų skaičius normalus ar mažesnis. Mažesnis kiekis siejamas su blogesne ligos prognoze. Tiriant T limfocitų populiacijas kartais aptinkamas padidėjęs CD8 limfocitų skaičius ir sumažėjęs CD8/CD4 santykis [5]. ĮKAG reikia diferencijuoti ne tik su antrine hipogamaglobulinemija, bet ir su kitais pirminiais humoraliniais imunodeficitais (3 lentelė). GYDYMAS Standartinis įprastinės kintamos agamaglobulinemijos gydymas pakaitinė terapija imunoglobulinu, kuri tęsiama visą gyvenimą. Turbūt tai yra vienintelis gydymo būdas, su kuriuo nebuvo atliekami placebu kontroliuojami klinikiniai tyrimai pripažinus, kad jie būtų neetiški pacientų atžvilgiu. Nepaisant to, gydymo efektyvumas yra visuotinai pripažintas [7]. Įprastinė rekomenduojama intraveninio imunoglobulino (IVIG) dozė yra mg/kg kūno svorio. Infuzijos atliekamos kas 3 4 savaitės, o siektina IgG koncentracija kraujo serume ne mažesnė kaip 5 g/l [1]. Tačiau pacientai turi skirtingus imunoglobulinų katabolizmo aktyvumo lygius ir tam, kad būtų pasiektas 5 g/l lygis, gali prireikti didesnių dozių ar dažnesnių infuzijų [2, 9]. Yra įvairių nuomonių dėl IVIG dozavimo. Weiler su bendraautoriais rekomenduoja pradinę dozę mg/kg kūno svorio siekiant, kad serumo IgG būtų mažiausiai 8,5 g/l [2]. Gydymas intraveniniu imunoglobulinu sumažina infekcijų dažnį. Pastebimas mažesnis poveikis viršutiniams kvėpavimo takams ir nerespiracinėms infekcijoms [9]. Pastebėta, kad IVIG veikia ir su ĮKAG susijusias autoimunines ligas, tačiau neveikia piktybinių ligų ir jau išsivysčiusių negrįžtamų organų pažeidimų, tokių kaip bronchektazės ar plaučių fibrozė, bet atitolina pastarųjų išsivystymą [7]. Retais atvejais bronchektazės gali tyliai progresuoti nepaisant adekvataus gydymo [11]. Piktybinės ir autoimuninės ligos gydomos įprastais metodais [4]. Pastebėta, kad gydant IVIG pacientus, sergančius teorija ir praktika T. 17 (Nr. 2) 223

4 ĮKAG, yra dažnesnės nepageidaujamos reakcijos nei taikant šį gydymą dėl kitų ligų [7]: 1. Anafilaktoidinės reakcijos proc. ligonių infuzijos metu atsiranda drebulys, paraudimas, dusulys, nugaros ar krūtinės skausmas, pykinimas/vėmimas, galvos skausmas, tachikardija, tachipnėja. Išsivysčius tokiai reakcijai, pakanka sustabdyti infuziją ir palaukti, kol simptomai išnyks. Premedikacijai galima naudoti aspiriną, antihistamininius ar kortikosteroidus. 2. Hiperterminė reakcija. 3. Anafilaksinės reakcijos. Jos gali išsivystyti pacientams, visiškai neturintiems IgA, dėl susidariusių IgG ar IgE klasės anti-iga antikūnių. 4. Ūmus inkstų nepakankamumas galimas dėl hiperosmozinio tirpalo infuzijos, todėl pageidautina adekvati paciento hidracija prieš infuziją ir atidesnis ligonių, sergančių inkstų ligomis ar naudojančių nefrotoksinius medikamentus, stebėjimas. 5. Virusinės infekcijos perdavimas. Moterims nėštumas nėra gydymo imunoglobulinais kontraindikacija, nes gaunama nauda yra didesnė už galimos nepageidaujamos reakcijos riziką. Be to, nutraukus infuzijas kūdikis negautų per placentą pereinančių IgG [7]. Lygiai toks pat efektyvus yra poodinis imunoglobulinas. Jis dažnai naudojamas kaip alternatyva intraveniniam, kai pastarasis sukelia nepageidaujamų sisteminių reiškinių, tokių kaip anafilaksija, aseptinis meningitas, dideli galvos, generalizuoti kūno skausmai, taip pat esant venų nepakankamumui trombozės ar angioedemos rizikai. Skiriama dozė 100 mg/kg kūno svorio vieną kartą per savaitę [2]. Sunkiais atvejais, esant nepakankamam gydymo imunoglobulinais efektui, būtina skirti profilaktinį gydymą antibiotikais [2]. Pacientų, sergančių ĮKAG, negalima skiepyti gyvomis vakcinomis, o skiepijant negyvomis netgi esant defektyviai B limfocitų funkcijai gaunamas teigiamas efektas [5]. Prognozė. Dažniausios priežastys, dėl kurių miršta ligoniai, sergantys ĮKAG, yra limfomos, plaučių uždegimas ir lėtinė plautinė širdis. 20 metų išgyvena 64 proc. vyrų ir 67 proc. moterų [1]. KLINIKINIAI ATVEJAI Vilniaus universiteto ligoninėje Santariškių klinikose (VULSK) diagnozuoti 5 ĮKAG atvejai. Ligonių amžius diagnozės nustatymo metu svyravo nuo 24 iki 48 metų. Trims pacientams imunodeficitą įtarė pulmonologas, kitiems dviem reumatologas ir hematologas. 1 atvejis. 30 m. vyras atvyko į alergologo-klinikinio imunologo konsultaciją dėl dažnų kvėpavimo takų infekcijų ir nustatyto mažo imunoglobulino kiekio kraujo serume. Vaikystėje jis sirgdavo rinosinuitu, kvėpavimo takų infekcijomis 4 5 kartus per metus. Nuo 12 m. kvėpavimo takų infekcijos pasunkėjo ir padažnėjo. Nuolat kartodavosi pūlingi bronchitai, sunkiai pasiduodantys įprastam gydymui. 29 metų buvo įtarta, tačiau nepatvirtinta plaučių tuberkuliozė. Atlikus krūtinės ląstos kompiuterinę tomografiją diagnozuota bronchektazinė liga. Tuo metu pirmą kartą nustatytas mažas kraujo serumo γ-globulinų kiekis. VULSK atliktuose tyrimuose: γ- globulinai 1,7 proc., Ig G 0,96 g/l (N 6,9 14), Ig M <0,2 g/l (N 0,34 2,1), Ig A <0,29 g/l (N 0,88 4,1), limfocitai 27 proc., 2700 /mm, T limfocitai CD3+ 85 proc., 2295 /mm (N proc. ir ), CD4+ 24 proc., 648 /mm (N proc. ir ), CD8+ 48 proc., 1296 /mm (N proc., ), CD4/CD8 0,5 (N 1,0 2,0), B limfocitai 9 proc. (N proc.). Buvo diagnozuota įprastinė kintama agamaglobulinemija ir pradėta pakaitinė terapija intraveniniu imunoglobulinu. IgG kiekis kraujyje svyravo nuo 0,96 iki 4,5 g/l, buvo pastebėtas teigiamas gydymo efektas. Kvėpavimo takų infekcijos pasidarė retesnės, o nuo gydymo pradžios pacientas nė karto nebuvo hospitalizuotas dėl infekcinių komplikacijų. 2 atvejis. Hospitalizuotas 27 m. vyras, besiskundžiantis karščiavimu, kosuliu, skrepliavimu, viduriavimu 5 6 kartus per dieną, kelių, pečių skausmu, blauzdų tinimu. Vaikystėje viršutinių kvėpavimo takų infekcijomis sirgo 3 4 kartus per metus. Nuo 16 m. kasmet kartojasi plaučių uždegimas. Kelis kartus sirgo pleuritu. 23 m. buvo diagnozuota hipogamaglobulinemija (IgG, IgM, ir IgA deficitas, su normaliu T ir B limfocitų skaičiumi, tačiau gydymas intraveniniu imunoglobulinu nebuvo skirtas). 26 m. įtarus reumatoidinį artritą apie 1 metus gydytas metilprednizolonu ir nimesulidu. Prieš atvykstant į mūsų kliniką pacientas buvo gydomas kitoje ligoninėje, kurioje nustatyta proteinurija ir hipoalbuminemija. Dantenų biopsija patvirtino AA tipo amiloidozę, o atlikus krūtinės ląstos kompiuterinę tomografiją buvo diagnozuota bronchektazinė liga. Pulmonologijos ir alergologijos centre nustatytas mažas imunoglobulinų kiekis kraujo serume: IgG<1,35 g/l, IgM 0,17 g/l, IgA<0,23 g/l, klinikiniame kraujo tyrime leukocitozė su nuokrypiu į kairę, CRB 72 mg/l, hipoproteinemija (30,9 g/l), hipoalbuminemija (14,8 g/l), nefrozinis sindromas (proteinurija 8,4 g/l ir 21,42 g/24 h), imunologiniame tyrime CD4/CD8 0,19, CD19+ 8 proc., CD4+ 15 proc. Urea ir kreatininas kraujo serume normos ribose. Krūtinės ląstos rentgenogramoje abipusė pneumonija. Pilvo organų echoskopijos metu matoma hepatosplenomegalija, ascito pėdsakų. Išmatose augo Citrobacter ir Candida. Dvylikapirštės žarnos biopsija patvirtino žarnų amiloidozę. Buvo taikytas gydymas antibiotikais, priešgrybeliniais preparatais, albumino tirpalo infuzijomis, diuretikais. Nustačius ĮKAG diagnozę pradėtas gydymas intraveniniu imunoglobulinu, tačiau dėl išsivysčiusių ligos komplikacijų po metų ligonis mirė. 224 teorija ir praktika T. 17 (Nr. 2)

5 IŠVADOS Įprastinė kintama agamaglobulinemija reta liga. Lietuvoje ši patologija mažai žinoma, todėl pernelyg vėlai diagnozuojama ir neadekvačiai gydoma. Ankstyva ligos diagnostika ir tinkamas gydymas intraveniniu ar poodiniu imunoglobulinu yra būtini tikintis lengvesnės ligos eigos ir siekiant išvengti komplikacijų ar atitolinti jų išsivystymą. Sergančiuosius ĮKAG būtina nuolatos stebėti dėl piktybinių ar autoimuninių ligų išsivystymo. Ligos diagnostikos ir gydymo situaciją gali pagerinti tik žinių apie šią patologiją skleidimas, medikų budrumo keistai infekcinėmis ligomis sergančių pacientų atžvilgiu skatinimas. LITERATŪRA 1. Kainulainen L. Common variable immunodeficiency. Anales Universitatis Turkuensis. Medica odontologica. Tom Turku. 2000; Weiler CR, Bankers-Fulbright JL. Common variable immunodeficiency: test indications and interpretations. Mayo Clin Proc. 2005; 80(9): Castigli E, Geha RS. Molecular basis of common variable immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2006; 117: Bonilla FA, Bernstein I, Khan DA, Ballas ZK, Chinen J, Frank MM, et al. Practice parameter for the diagnosis and management of primary immunodeficiency. Ann Allergy Asthma Imunnol. 2005; 94: S Scott H. Sicherer SH, Winkelstein JA. Primary immunodeficiency diseases in adults. JAMA. 1998; 279(1): Bayry J, Lacroix-Desmazes S, Kazatchkine MD, Galicier L, Lepelletier Y, Webster D, et al. Common variable immunodeficiency is associated with defective functions of dendritic cells. Blood. 2004; 104: Intravenous immunoglobulins in clinical practice. Ed. by Lee ML, Strand V. Marcek Dekker Inc. 1997; Cunningham-Rundles Ch. Common Variable Immunodeficiency Current Allergy and Asthma Reports. 2001; 1: Favre O, Leimgruber A, Nicole A, Spertini F. Intravenous immunoglobulin replacement prevents severe and lower respiratory tract infections, but not upper respiratory tract and nonrespiratory infections in common variable immune deficiency. Allergy. 2005; 60 (3): Jeffrey Model Foundation. The 10 warning signs of primary immunodeficiency Available from: patienttopatient/index.cfm?section =patienttopatient&content =warningsigns&cfid= &cftoken= Thickett KM, Kumararatne DS, Banerjee AK, Dudley R, Stableforth DE. Common variable immune deficiency: respiratory manifestations, pulmonary function and high-resolution.ct scan findings. Q J Med. 2002; 95: Gautas 2010 m. rugsėjo 27 d., aprobuotas 2011 m. vasario 4 d. Submitted September 27, 2010, accepted February 4, 2011 teorija ir praktika T. 17 (Nr. 2) 225